АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

О САМОПРОИЗВОЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ

Аэробные условия. В статье VII, часть шестая, нами была подробно описана микроскопическая картина, которую дает «н о р- м а л ь н а я» почва в смысле ее микробного населения. В этом случае можно было регулярно наблюдать группы или колонии кокков, приуроченные к скоплениям органических коллоидов. Численность этих кокков была различна, в зависимости от исследуемой почвы, но даже в случае наиболее плотно населенных почв микроскопическая картина не приближалась к тому, что наблюдается в искусственных культурах, столь знакомых микробиологу. Рост в виде маленьких разбросанных колоний сосредоточивался на твердых частицах почвы, и развитие в почвенном растворе наблюдалось лишь в известных условиях; препараты центрифугированной суспензии оказывались почти пустыми. Это особенно часто наблюдалось в почве, служившей контролем.

Однако можно было очень легко вызвать обильное прорастание клеток азотобактера из почвы, которая их содержала; надо было лишь прибавить к почве некоторое количество углеродного питания. После этого под микроскопом можно было убедиться, что самопроизвольная культура микроба развилась в естественной для нее среде.

Техника такого опыта очень проста. Берут образец почвы с выбранного участка и руками отбирают из него твердые примеси и растительные остатки; увлажняют до 18—20%, просеивают через фламбированное сито, отвешивают около 50 г такой почвы, тщательно смешивают с 0,5 г порошкообразного маннита, вносят в чашку Петри, диаметром 9 см, где почва образует слой около 1 см толщины; слегка прижимают почву ко дну чашки Петри, выравнивая ее поверхность при помощи шпателя. Наконец, чашки помещают в большой стеклянный сосуд, служащий влажной камерой, и ставят в термостат при температуре 28—30°.

После этого нужно лишь следить за «биологической реакцией» почвы при помощи микроскопической методики, описанной нами ранее (см. часть шестую).

Через 48 часов в почве развиваются крупные кокки, которые при микроскопировании встречаются в количестве около 30 на 0,1 мм2, что соответствует приблизительно 200 млн. на 1 г почвы. См. фиг. 1—3 табл. XXV и объяснения к ним.

Такой просмотр, повторенный 3—4 раза через каждые 24 часа, показывает, что размножение кокков достигло максимума. На препаратах получается картина богатой культуры, которая при подсчете дает 100—200 крупных кокков на 0,1 мм2, что эквивалентно более чем 1 млрд. на 1 г почвы.

При количестве около 2 млрд. на 1 г почва совершенно захвачена азотобактером. Почвенный раствор наполнен его клетками, и даже часть твердых почвенных частиц обволакивается слизью микроба.

Кроме маннита, можно вызвать развитие «самопроизвольных культур» аэробных фиксаторов азота при помощи большого числа различных углеводов: гексоз, пентоз, полисахаридов, а также спиртов и органических кислот. Нами были испробованы многие из этих веществ при помощи того же метода, что и в случае с маннитом. Глюкоза вызывает тот же эффект, что маннит; левулеза, мальтоза точно так же; галактоза вызывает более слабое и более позднее развитие; лактоза еще менее благоприятна. Пентозы явно хуже. Так, арабиноза лишь через три дня вызывает развитие микроба, при котором число его клеток не превышает 100 мл. на 1 г. При прибавлении ксилозы вдвое меньшее число клеток развивается лишь через пять дней.

С крахмалом размножение клеток происходит медленно, но все же оно заметно.

Целлюлоза в наших опытах не вызывала развития самопроизвольных культур азотобактера. Нами были испробованы с этими целями волокна бумаги и хлопка, осажденная клетчатка и растительные ткани, содержащие целлюлозу.

Глицерин вызывает довольно богатый рост азотобактера, в результате которого через пять дней число его клеток превосходит полмиллиарда на грамм.

Что касается органических кислот, которые были нами использованы в виде солей кальция, то среди них наиболее эффективным оказался лактат. В контрольной почве с лактатом число клеток азотобактера достигло через три дня почти миллиарда. Шаровидные клетки были меньшей величины и отличались от клеток тех рас, которые вырастали на манните и глюкозе, но все же это был несомненный азотобактер (см. табл. XXV, фиг. 4). Эта мелкая форма азотобактера, выделенная на кремнекислом геле с лактатом (см. следующую главу), сохраняла свои морфологические особенности.

Соли янтарной кислоты вызывают довольно запоздалый рост микроба (пять дней) в форме цепочек.

Соли лимонной и яблочной кислот дали положительный результат. Соли же кислот щавелевой, валериановой и муравьиной в тех двух опытах:, которые были нами поставлены, не вызвали роста азотобактера. Действие солей уксусной кислоты было сомнительно; если размножение клеток и происходило, то оно было во всяком случае незначительным и запоздалым.

Очевидно, можно было бы умножить эти опыты, испытывая еще большее число различных химических соединений и неочищенных веществ растительного происхождения. Но и тех, которые нами были приведены, достаточно для установления следующего закона в микробиологии:

Внесение в нормальную, хорошо аэрируемую почву различных углеводов, не сопровождаемое увеличением в ней количества доступного азота, способствует размножению в почве лишь коккообразных микроорганизмов, являющихся азотобактером, в то время как остальное микробное население почвы в этих условиях развивается слабо или остается в покоящемся состоянии.

Какова причина, обеспечивающая исключительное преобладание в этом случае микробов азотфиксаторов? В связи с этим возникает мысль, что как раз свойственная азотфиксаторам способность усваивать атмосферный азот позволяет им завладеть вносимым в избытке доступным углеродом в среде, лишенной азота, точнее, в среде, в которой отношение N : С упало до такой величины, которая не обеспечивает больше питания микробов неазотфиксаторов. Если это так, то вероятно, что прибавление в почву азота уничтожит эти условия, благоприятные для фиксаторов.

Чтобы проверить эту точку зрения, были поставлены следующие опыты.

Берут пять проб контрольной почвы в пересчете на сухой вес по 50 г каждая, вносят во все пробы по 0,5 г чистой глюкозы, доводят увлажнение почвы до оптимального при помощи воды: чистой дистиллированной в первом опыте и с прибавлением увеличивающихся доз азотнокислого калия в остальных.

Ничтожные следы связанного азота, имеющиеся в контрольной почве, пе приняты во внимание как не могущие существенно повлиять на указанные соотношения.   

Как было описано выше, все пять почвенных проб помещают в чашки Петри, диаметром 9 см, и выдерживают в термостате при 28—30°.

Через 24 часа производят первый просмотр под микроскопом.

В первой пробе еще нет никаких изменений.

Во второй, со внесением минимальной дозы азота, уже наблюдается значительное развитие палочек в количестве до 20 на 0,1 мм2 микроскопического прейарата. Азотобактера нет (см. табл. XXV, фиг. 5).

Что касается проб 3, 4 и 5, то они уже совершенно наводнены палочками, которые в неисчислимых количествах покрывают поле зрения под микроскопом, создавая картину обильной культуры этих микробов (см.

табл. XXV, фиг. 6).

Второй просмотр через 48 часов.

Проба 1. Появились крупные шаровидные клетки азотобактера 30— 50 на 0,1 мм2 препарата, т. е. несколько сотен миллионов на грамм.

Проба 2. Те же палочки, как накануне, превращенные в тени; красятся плохо. Число не увеличилось.

Третий просмотр через 72 часа.

Проба 1. Максимальное развитие азотобактера не менее 2 млрд. на 1 г. Вид чистой культуры.

Проба 2. Палочки без изменений. Появился в небольшом числе азотобактер до 75 млн. на 1 г.

Пробы 3—5 также не дают никаких изменений после бурного развития палочек в течение первых 24 часов (см. табл. XXV, фиг. 6, 7, 8).

Через три дня все указанные самопроизвольные культуры переходят в стационарное состояние.

Мы подробно описали эти опыты, так как они очень типичны. Они вполне определенно показывают, что внесение минимальных доз связанного азота немедленно и сразу же изменяет природу микробного населения почвы.

Достаточно было внести нитратный .азот в количестве лишь 5 на 100 000 весовых частей почвы, чтобы размножение азотобактера замедлилось и упало до V25 того, что наблюдалось в почве до внесения азота. Двойная же доза уже полностью прекратила развитие этого азотфиксатора.

Таким образом, в условиях избытка энергетического вещества в почве доступный азот регулирует в ней развитие двух антагонистических групп микроорганизмов. Как только отношение N : С приблизится или превысит 1 : 100, палочки завладеют средой, тогда как чем меньше становится это соотношение, тем вернее победа будет обеспечена за азотфиксаторами.

Если это так, то появление палочек в почве, обогащенной доступным углеродом, должно рассматриваться как указание на присутствие в ней «вязанного азота, и именно этим объясняется раннее развитие бациллярных форм в тех наших опытных почвах, в которые были внесены маннит или глюкоза. Вспомним, что оно всегда происходит до развития азотобактера, когда он еще совершенно отсутствует. Но преобладание палочек

незначительно и носит временный характер в пробе 2, так как в этом случае следы азота быстро используются ими, что останавливает их размножение и предоставляет свободу развития азотфиксаторам.

Надо осветить еще один пункт. Тот факт, что минимальные дозы нитратного азота препятствуют развитию азотобактера, вплоть до полного его прекращения, представляется с первого взгляда загадочным, тем более что опыты с чистыми культурами азотобактера показали, что более концентрированные дозы нитратов лишь благоприятствуют росту этого микроба; хотя при этом и наблюдается тенденция к снижению чистой прибыли фиксированного азота, что легко понять, но культура азотобактера развивается обильно. Будут ли выращенные в таких условиях штаммы в этом смысле отличаться от исходных?

Нет необходимости задаваться таким вопросом, настолько просто объяснение и настолько легко подтвердить его фактами. Ответ надо искать в соотношении энергии размножения интересующих нас двух групп микроорганизмов. При наличии в почве доступного азота обычно встречающиеся в почве палочки (группы subtilis, mycoides, cereus, mesentericus ит. д.) всегда опережают азотобактера, конечно, за исключением развития в условиях кислой среды. Чтобы составить себе представление о скорости,, с которой они самопроизвольно размножаются в почве, будет поучительно прибавить к 50 г почвы небольшое количество пептона (0,2—0,5 г) и про- микроскопировать ее после стояния в течение 3—4 часов в термостате при 30°. При первом же просмотре уже заметно развитие нитевидной палочки (см. табл. XXV, фиг. 7). При втором просмотре через 5—7 часов почва заполнена перепутанными нитями той же самой палочки (см. табл. XXV, фиг. 8).

Характер развития азотобактера совершенно иной. Для того чтобы он начал размножаться, ему необходимо пробыть в оптимальных условиях не менее 24 часов, причем и через 48 часов максимум еще не достигается. Некоторое время, видимо, необходимо микробу для того,, чтобы его инцистированные колонии (состояние, в котором его часто- встречают в почве) могли перейти в активное состояние и распространиться, вероятно, образовав подвижные клетки. Неизбежным следствием такого различия в темпах размножения этих двух групп почвенных микроорганизм оъ является быстрое, еще до появления азотф^- ксаторо в, истощение среды органическим питанием. Это происходит во всех тех случаях, когда палочки в состоянии разложить имеющиеся в почве источники углерода, а именно, когда они находят в почве необходимый для них связанный азот. После же того как энергетическое вещество в почве будет полностью израсходовано, развитие азотобактера станет невозможным.

Таким образом, мы видим, что в основе биологических факторов, регулирующих процесс азотфиксации, стоит тот же самый принцип, которому вообще подчиняется деятельность почвенных микробов и последовательная смена различных явлений в почве. Этот принцип носит название борьбы за пищу.

Самопроизвольные культуры, которые были нами описаны, легко получить из почв, содержащих азотобактер, или из «активных почв», как мы их назвали, отмечая важную биологическую особенность почв, в которых способен развиваться и питаться азотобактер. Но мы еще не предрешали, каковы физико-химические свойства почв, определяющие эту способность.

Подобные почвы часто встречаются на плато Бри. Многочисленные образцы были получены нами и из других областей Франции, равно как и из более отдаленных стран и различных континентов. В почвах всех этих образцов можно было получить развитие самопроизвольных культур азотобактера, применяя описанную выше методику. После выдерживания опытов в термостате при 30° развитие обнаруживалось с той же задержкой в 48 часов.

Вторую категорию составляли почвы, в которых тоже развивались самопроизвольные культуры, но развитие их шло несравненно медленнее и они были менее обильны. В этом смысле наблюдалось несколько градаций, начиная с почв, в которых отмечалось заметное развитие азотобактера лишь на 3-й день, и кончая такими, когда через 4—5 дней можно было насчитать лишь несколько клеток этого микроба в 0,1 мм2 препарата.

Наконец, третья категория почв в строго тех же условиях не давала абсолютно никакого развития азотобактера.

Из этих наблюдений можно сделать следующие выводы:

1.         Почвы первой категории богаты клетками азотобактера; они представляют среду, благоприятную для его развития. В этих почвах недостает лишь энергетического вещества, которое в них вносится.

2.         Почвы второй категории не только бедны клетками азотобактера, но и менее подходят как среда для развития самопроизвольных культур, иначе даже ограниченное число клеток азотобактера после более длительного периода инкубации смогло бы начать размножаться более энергично, чего, однако, не наблюдается.

3.         Наконец, почвы последней, третьей категории или не содержат клеток азотобактера или же являются средой, непригодной для размножения тех клеток микроба, которые в ней сохранились.

Для того чтобы решить, что препятствует развитию самопроизвольных культур азотобактера в почвах — отсутствие ли его клеток или же неподходящие свойства почвы,— надо лишь высеять подобные почвы на пластинки кремнекислого геля, пропитанные элективной средой, о чем мы подробно скажем в следующей главе.

Если колонии азотобактера появятся на пластинках, то этим будет доказано присутствие жизнеспособных клеток микроба в почве, и тогда отсутствие развития самопроизвольных культур будет объясняться неподходящими свойствами почвы.

Наоборот, если почва не даст роста микроорганизма на геле, то это будет свидетельствовать об отсутствии в ней азотобактера, причину чего надо искать в длительном отсутствии в почве условий, необходимых для существования этого микроорганизма.

Важно отметить, что существуют почвы, дающие рост азотобактера на кремнекислом геле, пропитанном элективной средой, и непригодные для самопроизвольных культур внутри самой почвы.

Это показывает нам, с одной стороны, в каком состоянии находятся клетки азотобактера в почве — в активном или в покое. Весьма вероятно, что в почвах, непригодных для самопроизвольных культур, микроб сохраняется лишь в неактивном состоянии, и наоборот.

С другой стороны, мы можем квалифицировать почву как беси л о д- ную для развития азотфиксаторов, если они в ней не размножаются, в то время как вне ее их развитие идет интенсивно.

Таким образом, возникает вопрос о поисках того, чего недостает такой бесплодной почве, например, тех или иных удобрений, которые возвратили бы ей способность давать самопроизвольные культуры.

Вопрос может касаться в данном случае лишь минерального состава почвы или ее физических свойств, так как во всех проведенных опытах почвы находились в одинаковых условиях и в равной мере получали энергетическое вещество. Исследования в этой области, проведенные до сегодняшнего дня при помощи старой методики, побуждают направить дальнейшие опыты в основном по следующим трем путям: по пути изучения влияния реакции почвы, степени насыщенности основаниями (количество извести) и содержания в ней доступной фосфорной кислоты.

Работа в этом направлении уже проводится.

Полученные результаты позволяют думать, что прямой и быстрый метод самопроизвольных культур может обогатить нас полезными сведениями относительно свойств почвы, которые имеют значение не только для процесса азотфиксации, но и вообще для сельского хозяйства.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ