АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

Определение азота.

Для химического анализа пластинки кремнекислого геля высушиваются при невысокой температуре; их оставляют открытыми на металлической пластинке в сушильном шкафу Ру.

Часов через десять гель с находящимися на нем колониями превращается в слой сухих бурых чешуек или в мелкий песок. Высушенная масса отделяется от стекла простым потряхиванием и переносится по частям в колбу Кьельдаля.

Следы сухой слизи, которые иногда остаются на стенках и на дне чашки Петри, счищаются при помощи маленьких свежеобожженных кусочков пемзы, и образовавшийся порошок сметается кисточкой в ту же самую колбу Кьельдаля.

Поправка для больших пластинок была определена в 0,7 мг; для пластинок диаметром 15 см—в 0,56 мг.

Оставалось только определить для каждой серии опытов азот в пластинке, которая принималась за контроль и которая засевалась той же почвой, с которой ставились опыты.

Вычитая этот азот из общего количества, фиксированного на пластинках, узнавали чистую прибыль его, которая приведена в таблице.

Само собой разумеется, что для всех анализов употреблялись одинаковые реактивы, в одинаковых количествах и свежедистиллированная вода. Для каждого опыта бралось: 20 мл серной кислоты, 3 г медного купороса, 7 г сернокислого калия, 100 мл дистиллированной воды (для обмывания колбы Кьельдаля после переливания продукта сжигания в перегонную колбу).

Перегонку производили в аппаратах Обина, снабженных длинным оловянным змеевиком. Для улавливания аммиака брали 25 мл децинор- мальной серной кислоты, которую титровали 1/20—1/25 нормальным баритом. Этот раствор барита сохранялся в 10-литровой бутылке, соединенной герметически с бюреткой и предохраняемой колонками с натронной известью. Его титр оставался постоянным неопределенно долгое время; кроме того, его проверяли в день титрования.

Обсуждение результатов.

 1. Просматривая количественные определения усвоенного азота по группам почв, можно отметить, прежде всего, регулярность и постоянство полученных данных. Они сходятся в пределах групп настолько совершенно, насколько это возможно в биологических опытах. Если вспомнить, что работа велась не с чистой культурой азотобактера, а со свежими образцами почв, взятых в природных условиях, то эта правильность еще более подчеркивает ценность полученных результатов. Таким образом, есть все основания говорить о специфическом «микробном аппарате», опыты же показывают, что этот «аппарат» работает с точностью, похожей на точность работы чистой культуры дрожжей в бродильном чане.

2. Что касается продуктивности, то, сравнивая между собой все опыты, в которых было отмечено массовое развитие аэробных азотфиксаторов, можно убедиться, что оно колеблется лишь между 9 и 11 мг на1г энергетического вещества. Среди исследованных почв важно различать две их категории и выделять на первое место почвы групп I—IV (за исключением III, 2). Эти группы обнаружили черты, типичные для почв, населенных азотобактером, а именно для них было характерно: максимальное число колоний микроба, раннее побурение этих колоний и легкость получения самопроизвольных культур. Такие почвы можно принять типичными для «активных почв» и процесс азотфикса- ции, вызываемый ими, можно считать «нормальным или стандартным». Продуктивность в среднем немного выше 10 мг на 1 г маннита, или точнее, отношение N : С, т. е. фиксируемого азота к окисленному углероду равняется 1:40 в условиях, приближающихся к природным. Количество вносимого маннита не влияет на это отношение. Значение дозировки, которое, казалось вытекало из факта, что усвоение азота в жидкой среде иногда шло энергичнее, если доза маннита уменьшалась, не получило подтверждения. В наших опытах испытывались дозы в 0,5; 0,8; 1 г, 2 г (это обычная доза) и, наконец, 2,5 г (см. группу VIII). Во всех случаях количество фиксированного азота приближалось к 1 %; абсолютное же его количество 'было соответственно около 5, 8, 10, 20 мг.

3.         Чтобы определить «нормальную энергию» процесса, была необходима предварительная рекогносцировка. Трудность применить химическую пробу для точного определения момента исчезновения маннита заставила нас обойти это осложнение, устанавливая срок, необходимый для получения максимальной прибыли а з о т^а. Когда этот максимум достигался, определяли количество израсходованного энергетического вещества. О завершении процесса можно было судить также по характерному виду культур — общее побуре- ние, оседание пузырьков газа, если они имелись. Для большей достоверности удлиняли срок культивирования до 10 дней, уменьшая вдвое дозу маннита (см. группы I, 3 и II, 2). Можно было убедиться, что везде, где замечалось энергичное развитие азотфиксаторов, максимум всегда достигался через 7 дней. Этот срок и был окончательно принят для больших пластинок, когда надо было определить только чистую прибыль азота. Но когда надо было сравнить энергию фиксации различных почв между собой, то, очевидно, необходимо было стремиться найти тот минимум времени, который соответствовал бы максимуму энергии. Чтобы найти этот минимум, была поставлена серия опытов со сроками, изменяющимися от 4 до 10 дней (см. группы I, II, VI). Для почв групп I и II было очевидно, что срок в 4 дня явно недостаточен для достижения максимума азотфиксации. Почва Бри-шпалерные посадки, которая является нашей почвой-стандартом, нуждается для этого по меньшей мере в 5 днях (группа II, 4), в то время как почва-контроль немного отстает. Еще более отстает почва Эль-Хаджар (группа VI), которая через 5 дней достигла лишь 75% конечной прибыли азота. Из сказанного можно заключить, что необходимо продолжать опыты минимум в течение 5 дней.

Наиболее совершенный и наиболее энергичный микробный аппарат азотфиксаторов окисляет в течение 120 часов при температуре 30° 2г маннита, фиксируя минимально 20 мг газообразного азота.

4.         Группы VI, VII и VIII объединяют образцы почв, лишь немногим менее активных, в то время как активность почв в группах IX и X отчетливо ниже.

Для трех первых групп число колоний на пластинках было в 5—6 раз меньше, чем для почвы-стандарта, для группы IX это число еще снизилось, и, наконец, почва «Большого луга» из парка Института (группа X) Давала лишь 3—5 колоний на первой и второй пластинках и ни одной на третьей. Чрезвычайно интересно, что участки, богатые азотобактером, находятся лишь на расстоянии каких-нибудь нескольких десятков метров от этих почв. И все же эта почва, очевидно совершенно непригодная для развития азотобактера, усвоила 14 мг азота в опыте, продолжавшемся 7 дней, и 7 мг в 14-дневном опыте. Из приведенных фактов и из многих других того же порядка вытекает, что при сравнении азотфиксирующей способности различных почв есть риск придти к ошибочным выводам, если при этом не учитывать фактора времени. Несколько клеток азотобактера, сохранившихся в покоящемся состоянии в почве пли случайно туда попавших, примером чего служит почва «Большого луга», могут дать в этом случае те же результаты, что и множество активных клеток этого микроорганизма в почве шпалерных посадок. Таким образом, две почвы, из которых одна неактивна, а другая в этом смысле стоит на первом месте, были бы приравнены одна к другой с точки зрения их способности к фиксации азота. Совершенно очевидно, что лишь правильно выбранный срок инкубации мог бы помочь выявить разницу между ними, причем эта разница будет выражена тем резче, чем срок инкубации будет короче. Ясно, что различие в числе микроорганизмов и в их активности особенно отчетливо будет чувствоваться в начале процесса, постепенно сглаживаясь с течением времени вследствие более энергичного разрастания немногих свободно разбросанных по пластинке колоний, по сравнению с многочисленными и густо покрывающими ее колониями, которые взаимно стесняют одна другую в росте. Для того чтобы составить себе представление о сказанном, достаточно понаблюдать, с какой быстротой редко расположенные колонии разрастаются в большие участки, завладевая поверхностью пластинки.

5.         Немногие опыты с анаэробами дали менее точные результаты. Они носят лишь предварительный характер. Пластинки сохранялись в эксикаторах с пирогаллолом. Больших колебаний в продуктивности в этих условиях не наблюдалось, и она составляла в среднем довольно точно 5 мг на 1 г маннита. Таким образом, если принять эту цифру, то окажется, что продуктивность анаэробного процесса составляет лишь половину продуктивности аэробного процесса. Что касается энергии процесса, то она еще не изучалась.

6.         Особо должен быть рассмотрен вопрос о том влиянии, которое оказывает вмешательство анаэробов в аэробный процесс азотфиксации, как мы это часто наблюдали на больших пластинках.

Естественно было думать, что деятельность анаэробов, продуктивность которых меньше, в соединении с аэробным процессом снизит количество фиксированного азота. Однако это пока не получило подтверждения. Две тропические почвы, одна с Коста-Рика (группа III, 3) и другая с Кубы (группа V, 1,2, 3, 4), дававшие на пластинке лишь ограниченное число колоний азотобактера, обнаружили цветущее развитие анаэробов, которое не наблюдалось в других почвах. Однако продуктивность каждой из этих почв оставалась максимальной, даже слегка превосходя в этом смысле продуктивность почвы из-под шпалерных посадок, которая, давая всегда прекрасные культуры аэробных азотфиксаторов, не обнаруживала роста анаэробов, а если их рост наблюдался, то лишь редко и только в виде следов. Таким образом, значение вмешательства анаэробов еще подлежит изучению.

Это вмешательство, однако, следует отметить в качестве признака, свойственного одним почвам и отсутствующего у других. Так, например, контрольная почва, лишенная растительности и не подвергавшаяся обработке, во всех опытах дала значительный рост анаэробов (от 1/3 до 2/з поверхности пластинки в пузырьках), что ее отличало от только что упоминавшегося участка, расположенного лишь на расстоянии десятка метров от нее.

7.         Шесть образцов почв, относящихся к группам XI и XII, и почва II1-2 не дают роста ни азотобактера, ни Clostridium. На пластинках вырастают лишь мельчайшие колонии олигонитрофилов, описанных на стр. 576. Пластинки сохранялись в термостате в течение гораздо более длительных сроков — в 12, 14 и до 20 дней, но после появления мелких колоний на них не замечалось больше никакого развития. Увеличение сроков инкубации не повысило азотфиксации выше тех следов азота, которые определялись по истечении 10 дней. Рост на пластинках, сохранявшихся 20 дней, был столь незначителен, что было бесполезно определять в них азоя1.

8.         Остается еще отметить некоторые случайные наблюдения, касающиеся влияния величины рН почв на их азотфиксирующую активность, хотя этот очень обширный вопрос не входит в план настоящей статьи.

Мы имели в сво1ем^распоряжении лишь три образца кислых почв: альпийские почвы, взятые с горного массива на Изере агрономом-инженером Риготаром. Один из них был «добыт с глубины 40 см из-под фирна на краю ледника, расположенного под Большим Ар но». Другой с высоты 2355 м в окрестностях того же самого ледника: очень низкая дернина с пастбища для рогатого скота. Наконец, третий был кусочком, вырезанным из луговины «на гребне Большой Воден на высоте 2600 м».

Эти образцы помечены на таблице под названием: из-под фирна, пастбище, гребень горы.

Два последних образца, очень богатые гумусом, имеют рН ниже 6,0, первый немного выше. Все три на пластинках оказались неактивными.

Все остальные наши образцы имеют щелочную реакцию, считающуюся благоприятной для развития азотобактера. Тем не менее некоторые из них не дали роста этого микроорганизма.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ