АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

СИНТЕЗ АММИАКА

Автор не считает необходимым снова давать здесь исторический обзор преобладающих идей по вопросу, касающемуся механизма фиксации азота. Достаточно сказать, что синтез аммиака через непосредственное связывание водорода и азота (гипотеза, насчитывающая почти вековую давность, так как она впервые была выдвинута Соссюром) считался большинством ученых наиболее вероятным с теоретической точки зрения. И не может ли пример промышленного химического синтеза аммиака, основанного на каталитическом воздействии, служить основанием для того, чтобы допустить существование аналогичного процесса в случае биологического синтеза?

Надо сказать, что опыты, проведенные в течение последней четверти текущего столетия, несмотря на очень большое число их, не смогли подтвердить эту гипотезу вплоть до 1930 г. Следы аммиака случайно наблюдались некоторыми авторами, но не было точных сведений ни о природе этого аммиака, ни об условиях, от которых зависело его появление.

Следует отметить, что различное происхождение аммиака не легко установить, так как аммиак является одним из наиболее обычных продуктов, выделяемых при разложении органических веществ. Без чрезвычайно тщательного микроскопического анализа культуры невозможно решить, происходит ли выделение аммиака в результате процессов разложения под воздействием посторонних микроорганизмов или вследствие автолиза клеток. В случае появления аммиака, если начать определять его после того как культура выдерживалась в термостате произвольно установленное число дней, невозможно решить, образуется ли он молодыми, взрослыми или старыми и, может быть, дегенерирующими клетками. В работах, опубликованных ранее 1930 г., такие данные отсутствовали.

Привлекает внимание касающаяся этого вопроса статья Костычева, Рыскальчук и Швецовой [3]. Авторы нашли значительное количество аммиака и аминного азота в своих культурах Az. agilis и без колебаний сочли его первым улавливаемым .продуктом синтеза азота.

Подтверждают ли их опыты это заключение? Автор настоящей статьи думает, что нет. Уже один тот факт, что химические анализы их жидких культур производились после 10—15 и даже 20—25 дней пребывания в термостате, с самого начала делал происхождение обнаруженного ими аммиака сомнительным. В статье ничего не говорится также о микроскопических признаках культур. Сохранялись ли они чистыми после такого длительного периода инкубации? Были ли они свободны от примеси авто- лизированных клеток? В работе имеется лишь упоминание, что исследовавшаяся коллекционная культура была этикетирована как Az. agilis и была получена благодаря любезности одного из их коллег. Количество азота, найденного в растворе, было, например, таково: одна культура содержала 13,4 мг общего азота, из которого 12,4 мг было аммиачного; в другой культуре было 10,7 мг общего азота, из которого 4,9 мг было аммиачного и 6,5 мг аминного. Присутствие последнего было обнаружено во всех культурах и трудно допустить, чтобы он имел какой-либо другой источник помимо разложения клеточного белка. Правда, авторы настаивают на аналогии между восстановительными процессами, вызываемыми азотобактером, и восстановлением нитратов плесенями, продукты которого — аммиак и аминный азот — накапливаются вне клоток в окружающей культуру среде; так же обстоит дело, как они предполагают, и с продуктами фиксации азота азотобактером.

Если бы это было правильным, то в естественных условрях палочки легко вытеснили бы азотобактера как это уже было нами ранее описано. Но ничего подобного не наблюдается на пластинках, засеянных почвой. Точно так же, по исследованиям Бэрка, Aspergillus niger не развивается в питательном растворе, в котором перед этим рос азотобактер, до тех пор, пока к последнему не будут прибавлены следы доступного азота.

Наконец, если образование таких значительных количеств аммиака представляет ссбой закономерное явление, то должно быть найдено объяснение противоположным результатам, полученным большинством исследователей, никогда никакого аммиака не находивших. Эти противоречия было бы легче понять, если бы авторами были применены какие-либо новые методы культивирования, которые позволили бы воспользоваться более чувствительными приемами для обнаружения выделяемого аммиака, но это не было сделано, так как авторы придерживались старой методики выращивания азотобактера в питательных растворах.

Подобная критика была уже сделана нами в нашем докладе на заседании Академии Наук 17 марта 1930 г. [8], в котором мы сообщали, что в наших многочисленных культурах на маннитной среде мы не наблюдали выделения аммиака. Далее, в том же нашем докладе следует:

«Одно отсутствие выделения аммиака еще не может служить доказательством несостоятельности гипотезы гидрогенизации молекулярного азота. Достаточно представить себе состояние идеального равновесия между процессом синтеза аммиака, с одной стороны, и его усвоением, с другой, чтобы понять его полное отсутствие в среде. Следовательно, при разрешении как настоящей проблемы, так и других, касающихся механизма микробной деятельности, важно находить условия, которые позволили бы вывести изучаемое явление из состояния равновесия, для того чтобы было возможно уловить первичный продукт. Именно по этому пути были направлены наши исследования.

Для нарушения равновесия можно было попробовать пойти по двум направлениям, а именно: или сделать аммиак более подвижным, менее способным входить в соединения, или затормозить ассимиляционные процессы внутри клеток. При таких условиях, если гипотеза гидрогенизации азота в результате деятельности микроорганизмов верна, неизбежно должно было бы начаться накопление аммиака в культурах.

Чтобы удержать аммиак в свободном состоянии, необходимо было повысить щелочность среды, насколько это возможно, чтобы не подавить значительно роста организма...

Самая простая и самая верная методика, позволяющая достигнуть этого, состоит в том, чтобы предоставить азотобактеру возможность самому вызвать такую чрезвычайно щелочную реакцию, культивируя его на кремнекислом геле, пропитанном органической солью натрия, лактатом или янтарно-кислым натрием, с прибавлением сверх того лишь обычных минеральных солей и, конечно, без связанного азота. В этих условиях разрушение кислотных ионов идет настолько быстро, что начальная величина рН = 6,8 через день повышается до 8,0, а через два дня до 9,0 и больше».

При таких обстоятельствах, укрепляя полоску красной лакмусовой бумаги на внутренней стороне крышки чашки Петри или пробуя реактивом Несслера капли воды, конденсированной на ней благодаря медленному испарению, которое при желании можно усилить, легко убедиться в выделении аммиака, не повреждая культуры. В пластинках кремнекислого геля, диаметром в 20 см, пропитанных 2—2,5 г солей молочной или янтарной кислот, через пять дней инкубации аммиак накапливается большей частью в количестве 3 мг на пластинку. Он определяется методом продувания без щелочи.

Для опытов употреблялись культуры, только непосредственно выделенные из почвы при помощи метода, описанного ранее. Культуры тщательно просматривались каждый день под микроскопом, но ни загрязнения, пи автолизированиых клеток в них обнаружено не было.

Эти наблюдения были подробно нами описаны в статье, касающейся этого вопроса, опубликованной в 1932 г. [10]. Однако, чтобы строго придерживаться хронологического порядка публикаций, вторая статья Ко- стычева и сотр. [4], появившаяся в 1931 г. в промежутке между опубликованием наших двух сообщений, будет разобрана нами раньше.

Авторы, очевидно, ничего не знали о первой из моих двух статей, так как они не принимают во внимание моих данных и даже не упоминают о них. В своей новой работе они описывают серию опытов, которые служат только подтверждением выводов первой. Но их установки представляются не вполне оправданными, поскольку ими применяется другая методика и выводы не совсем сходятся с прежними.

На этот раз они применяют метод, описанный нами в наших более ранних статьях (1926—1929), а именно они выращивают свои культуры в чашках Петри, диаметром 20 см, на пластинках из кремнекислого геля, пропитанного маннитом. Пластинки заражались штаммом азотобактера, выделенным из крымской почвы, и иногда, видимо, также почвенными частицами in natura. Если они не следили беспрерывно за выделением аммиака, то они начинали анализировать свои культуры после короткого периода инкубации в течение двух, четырех и шести дней, т. е. работали, следовательно, только с молодыми культурами. Наконец, ими упоминается о применении тщательного микроскопического анализа.

Количество аммиака в случае 2-дневной культуры измерялось долями миллиграмма и равнялось 1—2 мг для культуры, стоявшей от четырех до шести дней. Об аминном азоте ничего не упоминается. .

Поскольку результаты были совершенно ясные, то объяснение, что обнаруживаемый аммиак обязан своим происхождением процессу синтеза, было вполне обосновано; единственно вероятным заключением могло быть лишь то, что он выделяется молодыми, активными, фиксирующими азот клетками азотобактера.

Наряду с этим, теперь уже хорошо установленным фактом, было опубликовано новое наблюдение, а именно, что только тот аммиак, который обнаруживается в молодых культурах азотобактера раньше, чем углеводы в них будут использованы, обязан своим происхождением синтезу, в то время как аммиак более старых культур, в которых питательное вещество уже израсходовано, образуется в результате дезаминирования клеточной субстанции. Такой взгляд возник снова по аналогии с плесенями. В этом случае Костычев приписывает аммиаку, получающемуся при восстановлении нитратов, двойное происхождение: первичное при процессе восстановления, вторичное после исчезновения Сахаров вследствие дезаминирования клеточной плазмы. То же самое наблюдается в случае азотобактера: первичный аммиак — продукт синтеза, а вторичный аммиак — продукт дезаминирования.

Ясно, что единстр-шный способ неопровержимо доказать, что процесс дезаминирования действительно происходит в культурах, состоял в том, чтобы следить за балансом азота в клетках и в растворе, определяя постепенную убыль его в последнем. Но этот слишком трудный опыт не был проделан авторами; они только утверждают, что «другой способ образования аммиака невозможен в этом случае». Для подтверждения своего заключения авторами были проведены две серии опытов: 1) к культурам на пластинках из кремнекислого геля, выдерживавшимся в термостате в течение восьми дней и содержащим значительное количество аммиака, прибавляют свежую порцию сахара; это приводит к снижению количества аммиака и к значительному повышению количества общего азота; 2) при выращивании азотобактера в слабом растворе пептона и гликокола выделяется значительное количество аммиака только в отсутствие маннита, в то время как присутствие этого питательного вещества снижает количество аммиака до незначительных следов. Оба опыта показывают, что азотобактер действительно способен вызвать дезаминирование аминов и протеинов после разрушения углеводных питательных веществ.

Правильность утверждения Костычева относительно дезаминирования возбуждает сомнения, так как сам автор высказывает два противоположных мнения по этому вопросу: в первой статье он отрицает возможность дезаминирования при посредстве азотобактера, во второй он утверждает, что этот микроорганизм является энергичным возбудителем этого процесса .

Наша статья о синтезе аммиака при помощи азотобактера, опубликованная в марте 1932 г. [10], появилась так быстро вслед за второй статьей Костычева и др., что мы, в свою очередь, не смогли принять ее во внимание.

Эта статья посвящена подробному изучению выделения аммиака, условий этого процесса и характера его протекания.

Тот факт, что аммиак легко накапливается в среде, где он блокирован нелетучей щелочью, в то время как в обычных средах он большей частью не обнаруживается, казалось, показывал, что выделение аммиака не является ни в какой мере необходимой реакцией, сопровождающей рост азотобактера, но что оно вообще может зависеть от условий роста микроорганизма и, в частности, от состава питательных веществ.

Тогда было решено изучить влияние нескольких различных питательных веществ на характер выделения аммиака. Были испробованы маннит, глюкоза и лактат кальция в таких же точно условиях опыта, как в случае органических солей натрия — молочно-, янтарно-, уксусно-, масляно- и пропионовокислых. Наконец, были испытаны также этиловый и нормальный бутиловый спирты.

Было найдено, что при использовании веществ первой группы, которые являются лучшими или даже наилучшими энергетическими веществами, аммиак появляется поздно и только в виде следов; иногда его даже трудно обнаружить. В то же время в присутствии худших питательных веществ, в особенности жирных кислот и спиртов, аммиак легче накапливается до нескольких миллиграммов на большую пластинку в течение нескольких дней.

Все изложенные наблюдения приводят к гипотезе, что процесс фиксации азота идет в две фазы, из которых первой является синтез аммиака, второй — его ассимиляция. Эти два процесса не всегда хорошо сбалансированы между собой. Чем энергичнее рост, тем интенсивнее будет потребление аммиака.

С другой стороны, каждая задержка роста, какова бы ни была ее причина,— худшее ли качество питательного вещества, недостаток ли его или какие-либо другие неблагоприятные условия развития азотобактера,— приводит к снижению потребления аммиака, что влечет за собой выделение аммиака в среду.

Отсюда следует, что в почве, где азотобактер пользуется лишь менее ценными питательными веществами и снабжение ими периодически бывает недостаточным, условия будут особенно благоприятны для выделения аммиака наружу.

Если сравнить наши выводы с выводами Костычева и др., сделанными им в его второй статье, то можно заметить, что последний получал выделение аммиака в присутствии маннита гораздо легче, чем это удавалось нам. Однако это различие не должно рассматриваться как противоречие, так как если исследовавшиеся в этих опытах штаммы азотобактера были различного происхождения (Франция и Крым), то процесс фиксации азота, вызываемый ими, мог происходить различным образом.

Экспериментальные данные, как уже было отмечено выше, оказадцсь недостаточными, для того чтобы решить, действительно ли выделений аммиака в старых культурах можно приписывать процессу дезаминирования, как это считает Костычев. Но есть другой факт, который усложняет вопрос. Дезаминирование, как утверждает Костычев, является жизненным явлением, которое подавляется толуолом. Наше внимание было привлечено наблюдением, что клетки азотобактера, высушенные и растертые с песком и глицерином или убитые хлороформом, толуолом или эфиром, продолжали выделять следы аммиака в течение долгого времени. Если таковы факты, то становится правдоподобной мысль о специальном катализаторе или синтезирующем энзиме, который может быть выделен из клеток азотобактера. Но весьма вероятно, что тот же самый энзим может функционировать и в живых клетках микроорганизма, безразлично, будут ли они молодыми или старыми, одинаково вызывая выделение аммиака.

В нашу задачу не входит вдаваться здесь в детальное обсуждение этой чрезвычайно трудной проблемы, но мы считаем нужным дать краткий критический разбор последних исследований в этой области, насколько это необходимо, для того чтобы подчеркнуть их современное положение в науке и покончить с некоторыми недоразумениями.

Мы склонны думать, что наши наблюдения, в которых азотфиксирующие микроорганизмы действуют как возбудители и носители синтезирующего энзима, направят изучение всей проблемы биологической фиксации азота на новый путь, который, может быть, приведет к более ясному пониманию этой формы деятельности азотфиксаторов.

В заключение настоящего обзора следует подчеркнуть тот факт, что работы Костычева и др. и наша, проводившиеся хотя и при помощи одинаковой методики, но независимо одна от другой, ведут к одинаковым заключениям, а именно, что фиксация молекулярного азота азотобактером представляет собой восстановительный процесс, приводящий к синтезу аммиака в качестве первичного или одного из первпчных продуктов этой реакции.

Противоположной этому взгляду является совершенно иная теория предложенная Нэрном. Он особенно настаивает на факте, что все его усилия обнаружить аммиак в его культурах азотобактера оказались безуспешными [1, стр. 1188]:

«1. В жидкости отцентрифугированных культур не было обнаружено азота методом Кьельдаля. 2. При перегонке со щелочью в 10 миллилитро- вых порциях, взятых более чем из 200 колб Эрленмейера с культурами, выращенными в различных условиях и в различные сроки (до четырех месяцев), не было найдено даже следов аммиака, аминов или других летучих азотистых оснований (меньше чем 0,01 мл iV/100 NaOH или 0,014 мг азота). 3. Четыре штамма Aspergillus niger не развивались при заражении ими культур нескольких штаммов Azotobacter chroococcum, независимо oi возраста последних (до четырех месяцев). Но если одновременно в культуры азотобактера вносились следы связанного азота, то те же самые штаммы давали энергичный рост этой плесени менее чем в 24 часа. Культуры Azotobacter chroococcum любого возраста, подщелоченные карбонатом калия, можно было перегонять с паром в аппарате Прегля по микрометоду Кьельдаля в течение по крайней мере получаса и более, не обнаруживая при этом в дистилляте летучих оснований. 4. Более 200 культур были исследованы при помощи обычных и самых чувствительных кислородно-азотных и кислородно-водородных индикаторов с полностью отрицательными результатами».

Проведенные автором опыты, как можно было видеть, были очень тщательны и многочисленны. Но, несмотря на это, как общее правило при научных исследованиях, отрицательные факты не могут перевесить положительных, если последние достаточно многочисленны и точны, как в настоящем случае. Это лишь подкрепляет предположение, что автору, видимо, не удалось напасть на подходящий метод для получения положительных результатов.

Напомним еще раз, что полное отсутствие выделения аммиака не противоречит нашей теории, потому что баланс между выделением и потреблением аммиака может постоянно равняться нулю. Вполне возможно, что это является правилом для некоторых штаммов азотобактера, особенно для коллекционных, которые мы называем «сахарным» азотобактером.

Нечего было бы еще прибавить к сказанному о только что упомянутых отрицательных фактах, касающихся выделения аммиака культурами азотобактера, если бы теория Бэрка относительно «Азотазы и нитрогеназы в клетках азотобактера» [2] не была на них основана. Его теория указывает на отсутствие выделения растворимого азота культурами этого азот- фиксатора, как на существенное условие процесса. По этой теории активность азотазы, представляющей собой энзимную систему, нормально ограничена интенсивностью роста. Названный фиоэнзимом, этот энзим связан с ростом, т. е. со структурой живой клетки таким образом, что скорость образования продуктов реакции (внутриклеточных) параллельна и естественным образом ограничена скоростью роста. Образованные азотистые соединения находятся в клетках главным образом в виде протеинов и обычно не выделяются в среду молодыми и активными культурами.

Цитаты показывают, как бесконечно различны по существу те основные идеи, из которых возникли эти две теории. Не вдаваясь в критику данных той физико-химической статьи [2], в которой развита эта теория, мы считаем, что факты, приведенные в настоящей работе, стоят в явном противоречии с теорией азотазы.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ