ИССЛЕДОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ПРЕДИСЛОВИЕ (1945)

В настоящих исследованиях я ставил себе задачей изучение свойств симбиотической азотфиксации с целью сравнения с другими типами фиксации, аэробной и анаэробной, изучению которых я посвятил много труда и времени. Меня особенно побудило заняться этой проблемой то обстоятельство, что вопрос о механизме симбиотической фиксации почти не двинулся вперед, несмотря на большое количество замечательных исследований, принадлежащих многочисленным ученым, которые дали много сведений, касающихся взаимоотношений высшего растения с клубеньковыми бактериями. Более того, можно сказать, что за сорокалетний период исследований этот вопрос стал еще более неясным, особенно с тех пор, как было показано, что клубеньковые бактерии, выделенные в чистую культуру, не способен фиксировать азот.

Это неожиданное обстоятельство требовало новых опытов с применением методики, чувствительной к минимальной прибыли азота, ниже одного миллиграмма. Нами было проведено 14 серий опытов при различных условиях культивирования. Тем не менее результат был абсолютно отрицательным.

Нас более всего занимал вопрос, нет ли аналогии между двумя способами фиксации — симбиотической и несимбиотической — с точки зрения выделения аммиака. В отношении последнего способа происхождение аммиака казалось установленным (см. часть восьмую, статьи X, XI, XII, XVII и XVIII).

Выделение аммиака нетрудно было обнаружить и в первом случае, в органах фиксации — клубеньках. Вопрос заключался лишь в том, какова природа этого аммиака. Если в случае азотобактера аммиак появлялся почти с самого начала развития культуры, в среде, лишенной связанного азота, то здесь, наоборот, он выделялся в среде, достаточно богатой ами-нным азотом,— из клубеньков. Следовательно, условия выделения аммиака совершенно различны. В этом случае необходимо было считаться с возможностью автолитического дезаминирования. Этой возможностью, маловероятной, как будет видно дальше, не следует все же пренебрегать, что побуждает не спешить с выводом об источнике аммиака, выделяемого клубеньками.

Однако отбросить предположение о том, что мы здесь имеем дело с продуктами синтеза, а не с продуктами дезаминирования, не позволяет то обстоятельство, что аммиак выделяли именно органы азотфиксации, что это выделение было постоянным и общим среди бобовых, что1 оно наблюдалось у свежесорванных клубеньков в момент роста растения, и, наконец, по аналогии с другими типами азотфиксации.

Выделение азота происходит не только в лабораторных условиях на корнях с клубеньками или на сорванных клубеньках, но, судя по опытам Виртанена и Хаузена точно так же у целого растения в процессе совершенно нормального развития. В первый период развития растения, до цветения, количество выделенного азота даже больше, чем количество усвоенного азота; они уравниваются во время цветения, а к периоду плодоношения количество выделенного азота становится меньше, чем количество усваиваемого. В общем, повидимому, растение выделяет столько же азота, сколько усваивает. Если иметь в виду, что растение претерпевает потери в усваиваемом азоте в условиях недостатка этого азота, то невозможно понять, как же оно может избежать полного истощения. Следовательно, дело идет только о функциональном пороке патологического характера, который может привести к чахлому росту. А ведь известно, что культуры бобовых обильно и пышно развиваются даже на почвах, бедных азотом.

Необходимо отметить важную работу Демолона и Дунец  , которые подтверждают нашу теорию новыми опытами и развивают ее дальше. Приводим основные положения этой работы.

1.         Образование аммиака идет параллельно с дыханием. Отношение количества газообразного NH3, умноженного на 100, к количеству С02, которое обычно колеблется от 3 до 4, является мерой активности фиксации. Оно уменьшается в случае малоактивных культур.

2.         В атмосфере чистых газов — углекислоты, водорода, азота или кислорода — выделение прекращается. Кислород при умеренном давлении в присутствии азота необходим для выделения аммиака. В смеси углекислоты (2/3) и кислорода (V3) без азота никакого выделения не происходит.

3.         В полях, особенно на утомленных почвах, где симбиотическая активность замедлена, точно так же замечается уменьшение интенсивности образования NH3 в клубеньках.

Результаты упомянутой работы ясно показывают, что выделение аммиака клубеньками находится в прямой связи с клеточным обменом и с симбио- тической азотфиксацией, продуктом которой он является. Эти результаты не совместимы с представлением о дезаминировании клеток клубенька как о причине выделения аммиака.

Остается, конечно, еще многое сделать, чтобы осветить механизм явления, но факт выделения аммиака представляет исключительное значение для исследований по симбиотической азотфиксации.

О ВЫДЕЛЕНИИ АММИАКА КОРНЕВЫМИ КЛУБЕНЬКАМИ БОБОВЫХ

Проблема симбиотической фиксации молекулярного азота вызвала за последние полвека большое количество замечательных работ. Но, несмотря на все настойчивые исследования, химическая природа процесса остается еще неясной.

С точки зрения теории, из всех гипотез, которые были выдвинуты о механизме биологической фиксации азота, кажется наиболее вероятной гипотеза гидрогенизации атмосферного азота в аммиак, как первый стабильный промежуточный продукт. Действительно, выделение аммиака было констатировано в культурах азотобактера  . Однако эта реакция не была обнаружена при симбиотической азотфиксации, так как никому не удавалось наблюдать выделение аммиака в течение этого процесса.

Мы считали своей обязанностью направить наши исследования именно на этот предмет, оперируя просто с корнями, несущими клубеньки, или с оторванными клубеньками. Правда, мы имели дело со сложными объектами, но зато несомненно фиксирующими азот.

С первых же опытов стало ясно, что выделение аммиака легко наблюдать на этих объектах. Для этого стоило лишь поместить небольшое количество свежесорванных клубеньков в чашку Петри, прикрепив к внутренней стороне крышки розовую лакмусовую бумажку; достаточно 0,5— 1 г клубеньков, чтобы вскоре можно было заметить изменение окраски.

Чтобы проследить ход выделения аммиака и определить его количественно, мы пользовались промывательной склянкой, в которую помещали корни или оторванные клубеньки и через которую насосом протягивался воздух, очищенный от всяких следов аммиака. Выходящий из промы- валки воздух пропускался через iV/10 H2S04, окрашенную в желтый цвет индикатором — ализаринсульфонатом натрия. Титрование шло, так сказать, автоматически день и ночь. Конец титрования определялся по изменению окраски индикатора в розовый цвет.

Выделение аммиака появлялось через два, три часа и более. Были случаи, когда аммиак не выделялся вовсе, но это бывало редко. За начальным периодом наступал максимум, а затем на протяжении следующих двух- четырех дней наблюдалось быстрое падение. В качестве типичного примера можно привести следующий опыт, в котором начало выделения несколько запоздало.

100 г свежевыкопашых корней гороха с клубеньками, предварительно вымытых хорошо обсушенных, помещались в литровую промывательную склянку, присоединенную к насосу. В маленькую промывательную склянку наливалась TV/10 H2SO . Она сменялась, как только индикатор розовел, или оттитровывалась, если цвет не изменялся.

Делая выводы из этих опытов о выделении аммиака, образующегося в процессе синтеза, следует учитывать и возражение, что аммиачный азот мог возникнуть из вещества клубеньков, что мы имеем дело просто с процессом дезаминирования белков и аминокислот,

Последующие наблюдения не согласуются с этой точкой зрения.

1.         Вышеприведенные опыты, показавшие, что выделение аммиака свежими и молодыми клубеньками начинается сразу, противоречат такому предположению, потому что, как известно, всякое микробное воздействие требует для своего развития периода инкубации. Течение и характер выделения аммиака очень отличаются от явления дезаминирования.

2.         Оба эти процесса можно различить по действию антисептиков* и наркотиков, таких, как хлороформ, эфир, толуол, тимол: в то время как дезаминирование, как и все жизненные процессы, тормозится этими веществами, они не действуют на выделение аммиака клубеньками. Так, если поместить в чашку Петри навески клубеньков гороха от 1 до Зги подвергнуть их в целом виде действию паров хлороформа, толуола, эфира, или раздавить их и увлажнить толуолом или посыпать тимолом, то в течение 8—10 дней происходит посинение лакмусовой бумажки, что указывает на новое выделение аммиака.

Такая же устойчивость к антисептикам была обнаружена и в наших исследованиях по синтезу аммиака азотобактером. Это подало мысль, что здесь мы имеем дело не с процессом жизнедеятельности, а с э н з и- матическим процессом. В настоящем случае устойчивость против антисептиков была еще выше. Мало того, не только длительное действие антисептиков не приостанавливало выделения аммиака, но оно не прекращалось даже и тогда, когда мы пользовались клубеньками, высушенными при 45—50° в течение 20—24 часов и растертыми в порошок.

3.         Наконец, два* следующих опыта показывают, что корни в тех же условиях не выделяют аммиака»

Первый опыт. Свежевыкопанные корни гороха были отделены от и разделены на две части, по 50—60 г каждая. Одна была оставлена нетронутой, а у другой были оборваны, по возможности, все клубеньки. Из первой части выделилось три дня около 10 мг аммиака, из второй — незначительные следы. ъками

Второй опыт. Параллельно склянке с корнями гороха с ?лУ0е^узЫ включается промывалка, емкостью в 1 л, с таким же количеством корней Через прибор продувается воздух в течение трех дней. Оказывается, что корн курузы не выделяют и следов аммиака.          бобовых

Таким образом, корни злаков не способны выделять аммиак, a  таким

выделяют его лишь в тех случаях, когда на них имеются клубеньки, которы , образом, являются носителями этой специальной функции.

Позволяют ли все эти факты заключить, что действительно дело идет о синтезе аммиака симбиотическими органами? Можно возразить, что клубеньки, более богатые органическим азотом, легче могли бы разлагаться с выделением аммиака, чем сами корни; это может быть отнесено также, помимо воздействия микробов, за счет процесса автолиза клеток растения или микроорганизмов. Ясно, что для того чтобы отвести это возражение и поставить вне сомнения синтез, надо доказать, что клубеньки, выделяющие аммиак, не становятся беднее азотом. Опыты, которые сейчас проводятся, служат этой цели.

Независимо от того, каковы будут их результаты, только что установленный факт, заключающийся в том, что молодые клубеньки, находящиеся на растении в момент его интенсивного развития, выделяют в окружающую среду заметные количества аммиака,— сохранит все свое значение.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ