НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ИЗУЧЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

Мысль о том, что нитрификация аммиака в почве и в воде вызывается деятельностью специфического микроорганизма, была впервые в исторш науки высказана Шлезингом и Мюнцем (Schloesing et Mtintz) . Полученньи ими результаты послужили отправной точкой для целой серии выдающиха работ, однако до исчерпывающего разрешения вопроса было еще далеко

Я полагаю излишним описывать здесь опыты Шлезинга и Мюнца: ош приводились в литературе столь часто, что, несомненно, известны читателю В результате этих опытов было твердо установлено, что активная нитри фикация происходит лишь под действием низших организмов, населяющи: почву. Удалось ли этим ученым доказать, что данная функция присущ; лишь одному специальному виду микроорганизмов, что возбудцчгелз нитрификации действительно существует? В этом вопросе я присоеди няюсь к мнению Дюкло (Duclaux)   о том, что «если не дополнить результа ты, полученные Шлезингом и Мюнцем, всеми известными нам точным! сведениями из истории бесконечно малых существ, то нельзя признат] совершенным их толкование того факта, что нитрификация имеет мест< лишь при жизнедеятельности некоторых микроорганизмов; для доказа тельства подобного рода положений прежде всего следует выделит] в чистой культуре активный вид-, произвести его посев на соответствующую жидкую среду и показать, что она проявляет характерные реакции»

Действительно, эти авторы показали лишь вероятность существованш специфического возбудителя, доказав, что способность окислять солх аммония не присуща организмам, окисляющим какие-либо иные вещества например, некоторые микодермы, так же как и плесени, не вызываю1 нитрификации.

Названные ученые пытались выделить микроорганизм, обладающш специфической активностью. Достигнуть этой цели они надеялись путев ряда последовательных пересевов в стерильные жидкие среды, причев материал для посева каждый раз брался из наиболее молодой культуры Но, к сожалению, выделение тарификаторов не осуществляется стол] легко, и как мы увидим далее, подобным путем не удается удалить вс< посторонние виды.

У нас даже нет уверенности в том, что формы, наблюдавшиеся Шлезин гом и Мюнцем в процессе нитрификации в жидких средах, принадлежал] к предполагаемым возбудителям нитрификации, а не к каким-либ< банальным микроорганизмам, так как отсутствуют точные сведения о ходе нитрификации в культурах, которые эти авторы считали чистыми. Если нитрификация в них протекала интенсивно, то вполне обоснованно допускалось, что возбудитель нитрификации хорошо развивался и составлял цо крайней мере большую часть микрофлоры. Если при наличии пышного бактериального роста нитрификация была ничтожна и развивалась медленно, то, напротив, заключали об отсутствии активного вида, но более углубленная спецификация была неосуществима.

Мы видим, что после работ Шлезинга и Мюнца чисто бактериологическая сторона вопроса все же оставалась неясной. Однако общая постановка проблемы была ими разработана в такой степени, что можно было ожидать ее окончательного решения в направлении, намеченном французскими учеными-химиками. На долю бактериологов выпала задача уточнить все то, что было в этих работах лишь намечено в общих чертах.

Я не упоминаю о работах Уорингтона, Эмиха (Warington, Emich) и других ученых, которые, сообщая ряд интересных деталей, ограничивались лишь подтверждением выводов, сделанных Шлезингом и Мюнцем. Перейду к рассмотрению собственно бактериологических работ, целью которых являлось выделение одного или нескольких видов нитрификато- ров и изучение их морфологических и физиологических свойств.

С некоторых пор выделение микроорганизмов в чистой культуре стало посильной задачей для рядового бактериолога. Однако ученые, пытавшиеся выделить возбудителя нитрификации, терпели лишь неудачи, им не удавалось его обнаружить ни в почве, ни в воде, и решение вопроса, казавшееся столь близким, отдалялось все больше и больше.

В 1886 г. этой теме было посвящено четыре работы. Из них лишь Гереус (Heraeus)  сообщил о достижении им якобы положительных результатов. Интересно проследить, соответствует ли экспериментальная часть его работы такому выводу.

Этот ученый наметил себе задачу выделить некоторое количество видов из воды, воздуха и почвы и изучить их действие на аммиак и органический азот. Он применял обычную методику: посев на питательную желатину образцов воды или земли, культура в чашках Петри на плотных средах. Было выделено 12 видов из их естественных сред обитания: 3 вида из почвы, остальные — из воды Шпре и из ключевой воды. При культуре в жидкой среде, содержащей углекислый аммоний, сахар и минеральные соли, эти виды оказались неспособными окислять аммиак. Это было тем более поразительно,— говорит Гереус,— что два из изучаемых видов, выделенные из почвы, были распространены в ней в громадных количествах. Тогда для облегчения открытия специфических организмов в среде была предварительно вызвана активная нитрификация. Для этого в раствор аммиачных солей было введено некоторое количество перегноя. «Итак, в моем распоряжении,— говорит автор,— была жидкая культура, в которой шло окисление, и теперь я должен был найти микроорганизмы, вызвавшие это явление». Что касается организмов — в культуральной жидкости можно было обнаружить лишь очень тоненькую поверхностную пленку. Для проверки, действительно ли эта пленка содержит нитрифицирующие микроорганизмы, был произведен посев пленки кусочками в жидкие среды с аммонийными солями. Через 9 дней нитрификация в них была настолько отчетливо заметна, что оказалось возможным количественное определение азотистой кислоты при помощи индиго.

Таким образом, в распоряжении исследователя оказалось большое скопление специфических микроорганизмов и можно было приступить к выделению чистой культуры на желатиновых пластинках. Были выделены два вида; два других вида были выделены из мочи, хранившейся в течение трех недель, в которой реактив Троммсдорфа обнаружил присутствие- нитритов.

Опыты с чистыми культурами этих четырех видов дали следующие результаты: по истечении трех дней отмечалась заметная реакция с реактивом Троммсдорфа, через шесть дней реакция становилась интенсивной; однако концентрация образовавшегося нитрата была слишком ничтожна для количественного определения.

На этом опыты были приостановлены. Гереус, повидимому, считает полученные результаты положительными, но едва ли с этим можно 'согласиться.

Столь же мало убедительна серия опытов того же автора с большим количеством видов, взятых наудачу среди уже изученных микроорганизмов. Многие из них, как, например, Micrococcus prodigiosus, Bad. typhi, Bacillus anthracis, и другие, являются по словам автора, нитрифицирующими организмами, так как жидкая среда, в которой они развивались, давала по прошествии нескольких дней синее окрашивание с дифениламином.

Повидимому, Гереусу было неизвестно, что стерильные растворы,, даже лишенные аммонийных солей, при хранении в сосудах, не закупоренных герметически, постепенно обогащаются нитритами и нитратами, чрезвычайно широко распространенными в воздухе, в пыли, словом, повсюду. Кроме того, так как для их обнаружения употребляют очень чувствительные реактивы, экспериментатор должен с большой осторожностью делать ссылки на работу микроорганизмов, тотчас после появления синего окрашивания с реактивом Троммсдорфа, 'дифениламином или каким-либо другим высокочувствительным реактивом. Лишь интенсивная нитрификация, останавливающаяся только при полном превращении, аммиака, не оставляет никаких сомнений относительно роли микроорганизмов в этом процессе. В случае незначительной нитрификации необходимо принимать все меры предосторожности, для того чтобы действительно доказать участие микроорганизмов; при этом мы имеем право требовать от автора точных сведений относительно чистоты применяемых веществ иг в особенности, тщательной проверки при помощи стерильных контролей,. защищенных от загрязнения из воздуха.

Тем, кто сочтет эти требования чрезмерными, я советую обратиться к ранее опубликованной литературе об образовании нитритов и нитратов в воздухе при процессах испарения и горения, под действием щелочных соединений и т. д.

Особенно поучительна работа Баумана (Baumann) , разъясняющая вышеупомянутые спорные вопросы. Этот автор показал, что главным источником окислов азота в воздухе, в особенности в наших лабораториях,, является горение светильного газа, и что эти окислы выделяются в свободном состоянии вблизи пламени. Таким образом, щелочные растворы, предназначенные для изучения нитрификации, неизбежно их поглощают и постепенно ими насыщаются. От внимательного наблюдателя не может ускользнуть тот факт, что по истечении некоторого времени и культуры,, и стерильные контроли показывают нитритную реакцию.

Что же касается опытов Гереуса, то у нас нет уверенности в том, что автор не был введен в заблуждение следами азотистой кислоты, привнесенной извне. Так, например, он полагает, что наблюдал нитрификацию тогда, когда получил положительную иодкрахмальную пробу с мочой, хранившейся в течение нескольких недель, после того как в ней произошло аммиачное брожение мочевины. В действительности при подобных условиях опыта достаточно отсутствия или ослабления восстановительной деятельности микроорганизмов, для того, чтобы в культуральной жидкости, имеющей щелочную реакцию, стали медленно накапливаться нитриты.

Так как опыты Гереуса не были безупречны с точки зрения методики, мы не можем принять его выводы, согласно которым в мире микроорганизмов нитрификация не является специфической функцией одной группы, а скорее распространена широка Разумеется, мы отнюдь не утверждаем, что различные микроорганизмы не могут вызывать образования следов азотистой кислоты при соответствующих условиях; но для того, чтобы это доказать, необходимы более тщательные опыты, чем те, о которых идет речь. Помимо того, мы убеждены, что не следует смешивать этот вопрос с вопросом о нитрификации в почве. Гереус не открыл ни одного вида, обладающего достаточно интенсивной способностью нитрификация, для того чтобы ему можно было приписать осуществление этой функции в почве.

Франк (Frank)  в своей работе также пришел к отрицательным результатам; этот ученый-ботаник выделил микроорганизм, очень часто встречающийся во многих образцах почв, и изучил его с точки зрения его нитри- фикационных возможностей. Он нашел, что они равны нулю, так же как и у некоторых гифомицетов из родов Oidium и Torula, найденных в тех же почвах.

Целли и Марино Цукко (Celli at Marino Zucco)  экспериментально изучили пять видов Micrococcus, выделенных ими в Риме из воды, богатой селитрою. По истечении нескольких дней культуральная жидкость в их опытах давала положительную реакцию с дифениламином; однако такую же реакцию, лишь немного более слабую, давал незасеянный раствор аналогичного состава. Они сделали вывод о возможности нитрификации без участия бактерий, хотя последние могут сделать этот процесс более интенсивным.

Адаметц (Adametz)  терпел только одни неудачи. Во всех его опытах, длившихся многие недели, получились лишь следы нитратов. Вывод, сделанный им из этих исследований, гласит буквально следующее: в двух изученных им образцах почвы не удалось открыть ни одного вида Schi- zomyceteSy способного превращать значительные количества аммиака в азотную кислоту.

В 1887 г. Франк возобновил свои исследования в этой области. На этот раз он выступил в качестве решительного противника господствующего воззрения на природу возбудителя нитрификации, он искал причину этого явления в неорганических процессах, в частности — в воздействии щелочных соединений. Он безуспешно пытался вызвать к жизни эту старую теорию, всегда отличавшуюся туманностью своих доказательств.

Его опыты подверглись обстоятельной критике со стороны Ландольта, Плата и Баумана (Landolt, Plath et Baumann), лишний раз доказавших, что нельзя объяснить процесс нитрификации в почве исключительно влиянием чисто химических факторов. В своем ответе Франк настаивал главным образом на том, что он выделил в чистой культуре большое количество микроорганизмов из почвы «при помощи обычных методов», но никогда, несмотря на повторные усилия, не наблюдал в этих культурах ни малейших следов нитрификации. Хотя, по его словам, он, подобно другим ученым был в состоянии найти микроорганизмы там, где они действительно имеются и где они проявляют свою деятельность, он не принадлежал «к числу тех, которые приписывают деятельности каких- либо бацилл то, чего не могут объяснить».

В 1888 г. Уорингтон1 изучил большое количество бактериальных видов с точки зрения их нитрифицирующего действия. Ни один из них не нитрифицировал в чистой культуре. Однако при внесении небольшого количества земли в те же жидкие среды в них быстро развивалась днтенсивная нитрификация. Он пришел к выводу о необходимости поисков специфического микроорганизма.

Наконец, совсем недавно Перси Франкланд и Грэс Франкланд (Percy Frankland et Grace Frankland) поставили перед собой задачу изучить большое число микроорганизмов, распространенных в почве и в речных водах, и определить, оказывают ли они в нормальных условиях восстановительное действие на нитраты, с одной стороны, и окислительное действие на аммиак, с другой. Были выделены и тщательно изучены 12 видов. Редукция нитратов наблюдалась часто, но окисление аммиака — никогда. Однако посев небольшого количества той самой почвы, из которой были выделены эти микроорганизмы, легко вызывал интенсивную нитрификацию.

Из сделанного нами исторического обзора видно, что ни одна из новейших работ в данной области не дала положительного результата; даже само участие живых существ в описываемом явлении было взято под сомнение. Однако подобная мысль, на наш взгляд, заходит слишком далеко, так как это участие было безусловно доказано работами Шлезинга и Мюнца.

Следует ли отрицать существование специализированного нитрифицирующего организма потому лишь, что не удается его обнаружить, как это было в случае с Франком? Нет, напротив: сами неудачи делают еще более вероятным существование этого возбудителя, так как из них с очевидностью следует, что способность нитрифицировать встречается редко в мире микроорганизмов, и многие обычные для почвы виды ею не обладают. Следовательно, так как активными возбудителями процесса являются, вне всякого сомнения, живые существа, приходится признать, что здесь дело идет о специфической функции, свойственной очень немногим видам микроорганизмов, ускользавшим до сих пор от поисков экспериментатора, или даже одному виду.

В правильности этого мнения убедили проведенные мною исследования двух групп организмов, которые получили название серобактерий и железобактерий; читатель «Анналов»  должен быть знаком с их физиологическими особенностями. Именно эти работы побудили меня вновь приняться за интересующий нас вопрос. Если существуют одни организмы, окисляющие сероводород, и другие, приспособленные к окислению солей закиси железа, то можно с полным основанием допустить возможность существования специфических организмов, живущих за счет столь богатого источника энергии, как окисление аммиака почвы и естественных вод. Мои предыдущие опыты указывали на значение процесса окисления для этих организмов и тем самым дали довольно точное представление об OCHQB- ных признаках неуловимого возбудителя нитрификации.

Остается приписать длинный ряд отрицательных результатов лишь несовершенству методики, применявшейся для выделения вышеупомянутых микроорганизмов. Эта мысль может показаться несколько смелой современному бактериологу, справедливо гордящемуся точными и в известной степени безошибочными методами выделения микроорганизмов;, но каждый метод, как бы хорош он ни был в одном случае, может оказаться неудовлетворительным в другом. Уже известно большое количество бактерий, совершенно не развивающихся на средах, приготовленных на питательной желатине. Я производил опыты с окисляющими организмами, упоминавшимися выше, чье физиологическое сродство с предполагаемым возбудителем нитрификации вполне правдоподобно. Однако меры для устранения ошибок, вытекающих из этих фактов, принимаются слишком редко. Так, например, бактериологический анализ воды и почвы начинается с того, что небольшое количество этих веществ вносится в питательную желатину, разлитую по чашкам Петри. Если дело идет только о счете любых микроорганизмов, находящихся в данных субстратах, то с таким методом еще можно мириться; приходится удовлетвориться гем, что получаемые числа в большей или меньшей степени ниже истинных. Но когда при помощи той же методики берутся за изучение определенного микроорганизма, то рискуют столкнуться с одними лишь неудачами.. Если этот вид не образует колоний на желатине, то он не может быть изучен бактериологами. Действительно, введение небольшого количества земли в раствор аммонийных солей вызывает энергичную нитрификацию; однако при посеве той же почвы на питательную желатину образуются лишь колонии недеятельных видов. Какое же толкование этого факта будет правдоподобнее того, которое допускает, что нитрифицирующий микроорганизм отказывается расти на среде, содержащей желатину? При посеве на такую среду он непроизвольно отсеивается. Такой вывод напрашивается сам собой, особенно в некоторых опытах Гереуса, и можно* лишь удивляться, что ученый сам не пришел к нему.

Исходя из этих соображений, я решил отказаться от всех апробированных методик и придерживаться лишь одного, строго индуктивного метода. Открытие и выделение в чистой культуре нитрифицирующего организма было отнюдь не легким делом, и мои попытки, остававшиеся вначале бесплодными, могут представлять некоторый интерес с точки зрения методики. Именно эти соображения побуждают меня описать все этапы проделанного мною пути.

Вот общий план исследований, намеченный мною вначале:

1)        изыскать такие условия культуры в.жидкой среде, которые максимально благоприятствовали бы нитрификации;

2)        неизменно придерживаясь этих условий, провести ряд последовательных пересевов с целью устранения всех видов, не приспособленных к данным условиям существования;

3)        установив, что видовой состав культуры очищен в степени, исключающей дальнейшие изменения, и что нитрификация протекает интенсивно,, приступить к выделению отдельных видов для испытания в чистой культуре их нитрифицирующей способности.

В состав первой применявшейся мной жидкой культуры входили следующие минеральные соли: фосфорнокислый калий, сернокислый магний, углекислый калий (0,3%), хлористый аммоний и виннокислый калдй (0,01%) в качестве источника органического углерода. Для того чтобы вызвать нитрификацию, были взяты два образца цюрихской почвы: •один представлял собою перегной, богатый органическим веществом, другой — землю с меньшим содержанием органического вещества, но •богатую карбонатами. Различные количества почвы вводились в плоскодонные колбы с диаметром дна в 12 см, причем жидкость наливали в колбы невысоким слоем.

Результаты первых опытов были малоудовлетворительны. Развитие нитрификации задерживалось. По истечении 10 дней отмечались лишь следы реакции с дифениламином. Этот медленный темп развития показался мне подозрительным. Очевидно, условия культуры не благоприятствовали действию нитрификаторов. Я изменил щелочность среды, дозировку аммонийных солей, испытал различные соли аммония, однако без заметного успеха. Тогда я решил устранить присутствие всяких органических питательных веществ. Непосредственным результатом этого мероприятия явилась интенсивная нитрификация.

Тот факт, что избыток органического вещества не благоприятствует данному процессу, не представлял собою ничего принципиально нового. Гереус отметил это в отношении своих неочищенных культур. Мне самому уже был известен ряд организмов, прекрасно существовавших в растворах, •совершенно лишенных органического вещества. Повидимому, тарификаторы представляли собою аналогичный случай, так как больше не оставалось сомнений в том, что присутствие органических веществ тормозит нитрификацию.

В дальнейшем я пользовался исключительно раствором минеральных «солей естественной чистой воды, взятой из Цюрихского озера. По всей вероятности, специфические организмы в этой среде развивались хорошо, так как их активность не ослаблялась в длинном ряде проведенных мною опытов.

Заметив, что добавление углекислого магния благоприятно влияло на процесс, я окончательно остановился на питательном растворе следующего состава:

Сернокислого аммония . . 1 г Фосфорнокислого калия . 1 » Озерной воды    1000 мл

В колбу, содержащую 100 мл раствора, вносилось от 0,5 до 1 г основного углекислого магния в виде молочнобелой суспензии, стерилизованной кипячением.

В опытах, поставленных на этой среде, нитрификация приняла относительно регулярный характер. После посера ничтожно малым количеством материала, взятым из культуры, в которой недавно прошла нитрификация, на четвертый день отмечалась интенсивная реакция с дифениламином и серной кислотой; еще через два дня эта реакция достигала своего максимума; к пятнадцатому дню исчезали все следы аммиака. Таким образом, я мог считать первый пункт своей программы выполненным.

Тот же раствор, оставшийся стерильным, по истечении 15 дней показывал лишь следы реакции.

В ходе опытов с этой серией культур я периодически изучал их микрофлору. Мне удалось выделить на питательной желатине ряд форм. С ними оыли поставлены опыты по нитрификации. Результаты их оказывались всегда отрицательными.

Наконец, через три месяца видовой состав культур, повидимому,. стабилизировался. На пластинках всегда встречались одни и те же колонии, и если еще не было оснований приписать им свойство нитрифицировать, то уже не приходилось рассчитывать на уменьшение их количества путем тех же манипуляций, что и раньше.

Пора было попытаться выделить их всех без исключения и испытать действие их чистых культур на соли аммония. Для этого были использованы обычные приемы, однако без абсолютного к ним доверия. Не забывая о том, что возбудитель нитрификации мог ускользнуть при работе данными методами, я часто производил микроскопическое исследование культур. Именно ему я обязан, как мы увидим дальше, решением настоящей проблемы.

Я не буду подробно характеризовать все выделенные формы, так как они оказались совершенно не способными к нитрификации. Ограничусь лишь их перечислением, условно обозначив отдельные виды следующими буквами: а — микрококк, Ъ — мелкий Oidium, образующий на желатине- розовые колонии, с — длинные тонкие палочки, d — толстые палочки, е — мелкая почкующаяся форма.

Внешний вид нитрифицирующей культуры не представлял абсолютно ничего характерного. Жидкость над слоем карбоната обычно была совершенно прозрачной. На поверхности можно было различить тонкую, едва заметную пленку. Но время от времени, обычно на седьмой день, наблюдалось легкое помутнение жидкости. Это помутнение (или скорее опале- сценция) оказывалось очень кратковременным. Вызывалось оно овальными микроорганизмами, кишевшими в жидкости. Неоднократно отмечалось совпадение во времени между появлением этих подвижных стадий и интенсивной нитрификацией. Однако ни к каким определенным выводам прийти не удавалось, так как подвижные формы исчезали и дальнейшая их судьба оставалась неизвестной.

Казалось логичным искать их по аналогии с микодермами в поверхностной пленке, но многократные эксперименты показали, что микроорганизмы, образующие пленку, были совершенно неактивными.

Тогда я увеличил количество аммонийных солей, добавляя их постепенно по мере развития нитрификации. Тем самым я надеялся вызвать более пышный рост микроорганизмов в одном и том же сосуде, что могло облегчить открытие возбудителя нитрификации.

Вскоре я овладел ключом к раскрытию загадки.

Внимание мое привлек слой карбоната на дне сосудов. Я заметил, что внешний вид этого белоснежного мелкозернистого слоя изменялся в культурах, получавших дополнительные количества аммонийных солей. Соль приобретала сероватый оттенок и несколько слизистую консистенцию. При легком колебании колб после длительного состояния покоя этот осадок на дне не поднимался, обволакиваемый какой-то слизью, которая препятствовала передвижению карбоната в жидкости. При более сильном взбалтывании ровный слой осадка превращался в крупные сероватые хлопья. Под микроскопом эти хлопья представляли собой любопытную картину: они состояли из частиц соли, буквально сплошь усеянных скоплениями красивых овальных оактериальных клеток. Нельзя было не заметить полного сходства этих клеток по величине и форме с неоднократно наблюдавшимися подвижными стадиями. При добавлении к препарату небольшого количества разбавленнойуксуснойкислоты соль растворялась и взгляду представлялась типичная зооглея несколько рыхлого строения вследствие образования пустот.при растворении частиц соли. Очевидно, овальный микроб прикреплялся к частицам соли, обволакивая их студенистыми выделе- нийми. На поверхности жидкости и на стенках сосудов эти организмы отсутствовали почти полностью; все они скоплялись в слое карбоната, растворявшегося под их воздействием буквально на глазах.

Именно здесь концентрировался в нитрифицирующих культурах такой пышный рост, что по сравнению с ним всей остальной микрофлорой культуры можно было пренебречь. Теперь я был почти уверен в том, что нашел возбудителя нитрификации. Это подтверждается следующим фактом: при посеве следами жидкости, взятой с поверхности нитрифицирующей культуры, процесс не развивался. Тогда был изменен способ взятия посевного материала: только что вытянутый капилляр, запаянный на конце, погружался в нитрифицирующий раствор, и конец капилляра, вытянутый в тончайшую нить, обламывался о дно сосуда; мельчайшие хлопья, проникающие в капилляр, служили для посева. Уже через 24 часа проявлялась отчетливая нитрификация, а по истечении трех дней реакция систематически достигала своего максимума.

Тогда передо мной встала задача выделить этот микроорганизм и доказать безупречными экспериментами, что именно он и был возбудителем нитрификации. Но как за это взяться?

Никогда до настоящего времени этот микроб не развивался ни на питательной желатине, ни на агаре. Я решил попробовать лишний раз произвести обильный посев на этих средах. Хлопья, взятые со дна сосудов, содержали тысячи клеточек. За пластинками велось тщательное наблюдение. В течение трех первых дней не отмечалось никаких изменений. На четвертый день появились уже знакомые колонии микроорганизмов из пленки» которые постепенно распространились и на хлопья, помещенные на поверхности среды. Следовательно, при подобной засоренности культуры нельзя было применять обычные плотные среды. 'Нужно было найти способ удалить посторонние формы, еще противостоящие истощению. Мне пришла мысль попытаться вести культуру в том же растворе минеральных солей, но на дистиллированной воде и специально приготовленных предельно очищенных солях. Этот раствор был уже совершенно лишен следо~в органического вещества, и посторонние для нитрификации организмы, естественно, не могли развиваться. Но они оставались живыми и размножались при каждом пересеве, давая очень незначительный рост, в то время как предполагаемый нитрификатор размножался интенсивно.

Так как чистые продажные аммонийные соли часто содержат органические вещества, я был вынужден приготовить максимально чистый сернокислый аммоний. В качестве карбоната на этот раз была взята кальцинированная сода, заново насыщенная углекислым газом. На приготовление дистиллированной воды также было обращено особое внимание.

С этим раствором был проведен длинный ряд экспериментов, давших поразительные результаты: нитрификация проявлялась в те же сроки и Развивалась с тою же интенсивностью, что и раньше. Под микроскопом можно было видеть пышный рост овального микроорганизма, находящегося, по обыкновению, на осадке карбоната, и т. п. Все другие микроорганизмы, напротив, постепенно отсеивались. Так, после второго пересева я с Удовлетворением отметил исчезновение четырех из сопутствующих видов. Но пятый вид, условно обозначенный буквой е, упорно сопротивлялся. Попытки удалить его путем продолжительной культуры в том же самом растворе ни к чему не привели, и в конце концов я потерял -надежду избавиться от него при помощи истощения. Однако количество его было незначительно и не превосходило 20 ООО в 1 мл.

Таким образом, методом исключения было точно установлено, что микроорганизм, открытый на дне сосудов, являлся возбудителем нитрификации. Не оставалось никаких сомнений относительно причины неудач моих предшественников.

Нитрифицирующий организм был теперь достаточно ючищен для постановки опытов по нитрификации в средах, лишенных органического вещества, так как не было никаких оснований приписывать сколько-нибудь значительное действие столь слабо представленной ^сопутствующей форме.

Но для выполнения намеченного плана исследований надо было освободить микроб от всех посторонних организмов. При наличии культуры, очищенной в достаточной степени, мне казалось возможным использовать для этого его отрицательное свойство — отсутствие роста на питательной желатине.

Итак, м е т о д был применен в обратном смысле — не для выделения активного микроорганизма, а для обнаружения примешанных к нему засоряющих форм.

С помощью стеклянного капилляра со дна сосуда извлекалось несколько крупинок осадка и переносилось в сосуд со стерильной водой; осевшие на дно частицы карбоната вторично захватывались тем же капилляром и наносились отдельными каплями на поверхность застывшей питательной желатины. Капли жидкости быстро впитывались желатиной, но место их нахождения оставалось отмеченным частицами карбоната. После выдерживания в течение 10 дней при 18° эти участки подвергались микроскопическому исследованию. Всякий раз некоторые из них оказывались свободными от колоний. Тогда под лупой из таких участков извлекались частицы карбоната и переносились в жидкую среду для нитрификации.

Таким способом я засеял шесть сосудов. Во всех сосудах нитрификация проявилась с заметным запозданием вследствие незначительности количества посевного материала. Все сосуды, за исключением одного, не содержали посторонних организмов. Чтобы убедиться в этом, был произведен посев несколькими крупными каплями, взятыми после взбалтывания, на косую питательную желатину. Контрольные пробирки остались стерильными. Итак, мне удалось выделить чистую культуру нитрифицирующего микроорганизма.

Подведем итог работам, изложенным в настоящей статье.

1.         Шлезинг и Мюнц были правы, приписывая явление нитрификации деятельности некоего специфического микроорганизма.

2.         Этот организм поддается культивированию и выделению на минеральной среде, лишенной следов органического вещества. На данной среде процесс идет интенсивно вплоть до полного окисления всего запаса аммонийных солей.

3.         Противоположные результаты, полученные моими предшественниками, объясняются применением ими методики, не соответствующей поставленной цели.

Говоря о возбудителе нитрификации, я отнюдь не утверждаю, что на земном шаре существует лишь один единственный вид, способный осуществлять эту функцию. Я считаю это даже маловероятным. Под термином «возбудитель нитрификации» я понимаю скорее определенный •физиологический тип. Весьма возможно, что морфологические особенности у микроорганизмов, происходящих из различных мест, будут расходиться и придется выделить несколько видов или разновидностей. Полагаю, что количество их будет невелико. В цюрихской земле, например, я нашел всего одну форму. Все эти вопросы разъяснятся в процессе дальнейших исследований.

Целью настоящей статьи является выяснение действительных причин нитрификации в почве. Я вынужден был обратить особое внимание на^ методическую часть своей работы, столь важную во всяком микробиологическом исследовании, для того чтобы заслужить доверие читателя. В следующей статье будут рассмотрены отличительные признаки этого микроба. Нет никаких сомнений в том, что именно данный организм является возбудителем нитрификации в почве. При сопоставлениии опытов Щлезинга по нитрификации в почве с нашими работами на искусственных средах можно убедиться, что интенсивность нитрификации в обоих случаях выражается величинами одного и того же порядка.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ