НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ИЗУЧЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

Нитрифицирующие микроорганизмы

В предыдущей статье я изложил свои взгляды па природу нитрификации в почве и описал путь, который привел меня к открытию активного возбудителя этого процесса. Настоящее сообщение посвящено изучению самого микроорганизма, его морфологии, способности к нитрификации и наиболее отличительных особенностей его питания.

Микроб, выделенный из цюрихской земли, по форме напоминает более или менее вытянутый эллипсоид, у очень молодых особей приближающийся к окружности. Длина меньшего диаметра эллипсоида почти всегда лежит в пределах от 0,9 до 1,0 (л; длина большего варьирует между 1,1 и 1,8 jx. На более удлиненных клетках уже можно заметить перетяжку, предшествующую делению. Иногда среди овальных клеточек встречаются веретенообразные формы с притуплёнными концами; количество их обычно невелико, но временами они становятся преобладающей формой.

Клетки, большую часть времени неподвижные, периодически приходят в движение. Способность двигаться свойственна, вероятно, всем особям, однако большей частью они находятся в состоянии покоя. Затем внезапно наступают периоды интенсивного всеобщего движения, продолжающиеся всего лишь несколько часов. Культуральная жидкость мутнеет, в ней кишмя кишат клетки, стремительно перемещающиеся во всех направлениях и энергично описывающие различные замысловатые фигуры. На следующий день все снова приходит в состояние полного покоя.

Деление происходит исключительно в направлении, препендикулярном большей оси; тотчас по достижении определенной длины дочерние клетки расходятся; цепочка, составленная из 3—4 особей, является большой редкостью, длинные нити и споры никогда не образуются.

Клетки, находящиеся в состоянии покоя, встречаются в густых скоплениях в форме бесструктурных зооглей. Выделяемое ими слизистое вещество, судя по легкости распадения хлопьев, отличается небольшой вязкостью. Микроорганизм получил родовое наименование Nitrosomonas, отражающее его функцию.

В первой статье мною был описан характер роста Nitrosomonas в жидких культурах в присутствии карбоната магния или кальция. Микроб фиксируется на крупинках или хлопьях карбонатов таким образом, что весь осадок равномерно заполнен клетками и под воздействием микроба со временем растворяется. Очевидно, для роста клеток необходим непосредственный контакт с углекислыми солями щелочноземельных металлов, по крайней мере в средах, не содержащих растворимых оснований или содержащих их в недостаточном количестве. Если карбонат находится в виде плотных комочков, не распадающихся в жидкости (например, нейтральный углекислый магний), то любопытно проследить, как под действием клеток, скопляющихся на отдельных комочках, карбонат исчезает и заменяется бактериальной зооглеей.

Наблюдаемое в культуре фиксирование микроба на частицах щелочноземельных карбонатов и последующее растворение их, несомненно, имеют место PI в природе. Таким образом освобождается углекислота, находящаяся в этих солях в связанном состоянии.

Большинство исследователей, изучавших данный вопрос, отмечали в жидкостях в процессе нитрификации присутствие лишь незначительных количеств нитритов и нитратов. Вследствие этого сложилось впечатление, что вне почвы интенсивность нитрификации всегда невелика. Несколько примеров, взятых из многочисленных определений, проделанных мною, легко докажут обратное.

1.         Возраст культуры — несколько недель. Образовалось в общей сложности 1,272 г азотнокислого магния.

2.         Возраст культуры — 20 дней. Образовалось в общей сложности 0,827 г азотнокислого магния.

Были проведены специальные исследования для сравнения хода нитрификации в моих культурах и в почве. Для сравнения были взяты данные из новейших работ Шлезинга .

Вполне очевидно, что в моих культуральных сосудах условия жизнедеятельности микроорганизмов не могли быть столь же благоприятны, как в заполненном землею приборе Шлезинга. Я хотел лишь убедиться в возможности достичь в условиях микробиологического эксперимента на жидкой среде интенсивности процесса, близкой к наблюдаемой в естественных средах; это доказало бы, что нитрификационные возможности нашей нитромонады не многим меньше, чем у настоящих нитрификаторов в почве.

В этих целях потребовалось создать максимально благоприятные условия для интенсивной и длительной нитрификации. Одно из основных условий — отсутствие избытка аммонийных солей. По мере их исчезновения в процессе нитрификации следует добавлять небольшие порции раствора сернокислого аммония в количествах, не превышающих нескольких сотых грамма на 50 мл минерального раствора.

Чтобы вызвать нитрификацию в данных опытах, следовало при посеве ввести сразу большое количество микроорганизмов, создавая тем самым подобие плодородной, обильно заселенной микробами почвы, применявшейся в работах Шлезинга. Для получения большого количества микроорганизмов для посева культуры профильтровывались через небольшой тампон из прокаленной асбестовой ваты. Тампон слегка промывался стерильной водой и переносился при помощи фламбированного пинцета в новую культуру. Таким образом, в каждую среду вводились все мнкроорганизмы культуры, окислившей от 1 доЧ,5 г сернокислого аммония.

Жидкой средой служил раствор фосфорнокислого калия, в который дооавлялся углекислый магний. После стерилизации в среду приливалось градуированной пипеткой желаемое количество титрованного раствора сернокислого аммония.

Через каждые 24—28 часов производилось испытание культуральной жидкости: капля раствора вносилась в маленькую пробирку с реактивом

Несслера; появление желтого окрашивания указывало на присутствие аммиака. Предел чувствительности реакции лежал между 0,0005 и 0,00025% водного раствора аммиака. После исчезновения аммиака в культуру вновь добавлялось от 2 до 5 мл аммонийного раствора (1 мл соответствует 20 мг), в зависимости от хода нитрификации.

Таким образом, избегая избыточной щелочности среды, можно было подробно изучать ход нитрификации.

В приводимой ниже таблице показано количество соли аммония, окисленной двумя культурами, из которых культура II содержала боль шее количество организмов. Значки, стоящие у соответствующих дат, означают следующее: + + интенсивная реакция (хлопья ржавого цвета); + слабая реакция (светложелтое окрашивание без хлопьев), 0 — отсутствие реакции. Культуры выдерживались при температуре в 20—22°.

Культура I в течение 37 дней окислила 860 мг сульфата, или 182,4 мг аммиачного азота, что составляет в среднем 4,93 мг окисленного азота в день. В наиболее активный период (с 18 марта по 5 апреля) эта средняя величина достигает 6,7 мг.

Культура II за 30 дней окислила 930 мг сульфата, или 197,3 мг азота, что составляет 6,6 мг окисленного азота в день. Если исключить период инкубации (с 25 марта по 2 апреля), средняя величина возрастает до 7,7 мг.

Не приписывая этому сопоставлению особого значения, можно, тем не менее, видеть в нем доказательство того, что нитрификация в очищенной культуре в какой-то степени воспроизводит деятельность микроорганизмов в почве.

Перейдем теперь к рассмотрению одного чрезвычайно примечательного свойства этих бактерий, о котором я упоминал в своей первой статье. Я имею в виду их способность давать обильный рост на средах, лишенных органического вещества.

Еще до меня было замечено, что нитрификация может продолжаться в средах без дополнительного введения в них органических веществ. Но эти наблюдения не отвечали на вопрос, могут ли бесцветные организмы в нормальном состоянии обходиться без органического питания. Для опровержения доктрины, признанной физиологами всего мира, нужны доказательства более веские, чем приводимые ниже.

Гереус  в своей работе, о которой я упоминал в первой статье, отмечал, что кусочек зооглеи, извлеченной из энергично нитрифицирующего почвенного настоя, при пересеве в раствор минеральных солей, лишенный органического вещества, давал сравнительно обильный рост в виде пленки на поверхности жидкости.

«Общепризнанной неопровержимой истиной считается в физиологии растений положение о том,— говорит этот автор,— что лишь хлорофил- лоносные растения могут ассимилировать углекислоту; все остальные растительные формы, в том числе и бесцветные бактерии, требуют для своего развития органического питания. Как согласовать результаты предыдущих опытов с этой неопровержимой истиной? Этот вопрос в настоящее время остается без ответа».

Значение, которое Гереус приписывает своему наблюдению, ничем не оправдано, так как это наблюдение отнюдь не противоречит классическим положениям.

Прежде всего нет уверенности в абсолютной чистоте применявшихся солей и дистиллированной воды. Не следует также забывать о том, что вместе с посевным материалом вносится небольшое количество жидкости. Затем, в самих перевиваемых клетках имеется некоторый запас питательных веществ, распределяющийся впоследствии, вплоть до его истощения, [среди большого количества молодых клеток. Однако рост этих клеток сопровождается уменьшением процентного содержания в них сухого вещества; возможно, что в нем самом уменьшается содержание углерода.

Подобные рассуждения опираются на многочисленные, твердо установленные факты. Известно, например, что споры грибов прорастают в дистиллированной воде, что дрожжи в течение некоторого времени в ней размножаются и т. п. Наиболее поучительны в этом отношении факты, относящиеся к прорастанию в темноте явнобрачных растений; молодое растение, вынужденное довольствоваться лишь углеродом семени, прорастает почти нормально, количество его клеток увеличивается, растение достигает величины, в сотни раз превосходящей величину семени, но одновременно с этим теряет органическое вещество, так что в конце концов его сухой вес не достигает половины сухого веса непророс- шего семени.

То, что в настоящем случае мы имеем дело с бактериями, ничего не меняет в нашей аргументации. Никогда нельзя судить по увеличению роста об увеличении сухого веса бактериальной массы. Появление мути, хлопьев и пленок может прекрасно сочетаться с потерей вещ. ства, а не с его образованием.

Если Гереус в своих суждениях придерживался известной осторожности, то Хюппе (Hueppe) , внимательно следивший за его опытами (они проводились в лаборатории Хюппе), высказывается уже вполне определенно. Это явление (рост в отсутствие органического вещества),— говорит он,— «поразило меня настолько, что я стал за ним наблюдать. Оказалось, что одна из нитрифицирующих бактерий действительно могла развиваться в отсутствие органического вещества как в темноте, так и на рассеянном свету. В процессе роста она синтезировала из углекислого аммония какой-то углевод, весьма сходный с целлюлозой». Здесь как будто бы имело место «действие хлорофилла в отсутствие хлорофилла», да к тому же еще совершенно не зависящее от света. Освобождающийся кислород, вероятно, шел на окисление аммиака и вследствие этого не обнаруживался в свободном состоянии.

Следует припомнить сказанное о псевдоиитрифицирующстх бактериях 1>реуса в моей первой статье. Это избавит меня от необходимости обсуждать гипотезу, основанную на догадках, а не на количественных исследованиях.

Уже при первых моих опытах я был поражен относительным обилием специфического микроорганизма в жидких средах, почти совершенно лишенных органического вещества. Неожиданным было не то, что обильный рост возникал при первом или втором пассаже, а то, что он наблюдался и при всех последующих. Это говорило о нормальном развитии микроба, так как трудно допустить, чтобы состояние постоянного истощения сопровождалось увеличением числа особей и их значительной активностью.

Для изучения этого вопроса был приготовлен раствор, свободный от малейших следов органического углерода.

Вся стеклянная посуда, служившая для приготовления питательных растворов и ведения самой культуры, очищалась кипячением в серной кислоте. Употреблявшаяся вода дважды перегонялась, причем второй раз с добавлением серной кислоты и перманганата калия. Дистилляция велась в аппарате, изготовленном только из стекла, без каучуковых и пробковых соединений. Что же касается солей, то сернокислый магний, фосфорнокислый калий и углекислый кальций были прокалены, а последняя соль еще дополнительно насыщена углекислым газом; для получения чистого сернокислого аммония перекристаллизованный с содой хлористый аммоний разлагался нагреванием и полученный раствор аммиака нейтрализовался разведенной серной кислотой. Кислота до разведения кипятилась, а затем разводилась в пропорции 1 : 10. Ватные пробки были заменены хорошо прокаленными асбестовыми.

Окончательные результаты этих опытов, продолжавшихся три месяца, таковы: интенсивность нитрификации и темп развития в последовательных культурах не ослабели; при микроскопировании ничто не указывало на истощение клеток. Я должен при этом добавить, что культуры выдерживались в полной темноте.

Для окончательного решения вопроса требовалось количественное определение органического углерода во вновь образовавшихся клетках и в культура л ьной жидкости, в которой в начале опыта он полностью отсутствовал. Разумеется, эти определения можно производить и в средах, содержащих следы органического вещества, при условии аналогичных определений в контроле или в равных количествах стерильной жидкости.

Так как определение органического углерода сухим способом представляло в настоящем случае чрезмерные трудности, я применил метод, основанный на сжигании органического вещества смесью серной кислоты и бихромата калия. Не буду входить здесь в детали этого метода, разработанного в трудах Вольфа, Дегенера и Герцфельда (Wolf, Degenei и. Herzfeld) , а ограничусь лишь некоторыми замечаниями относительно его осуществления. Исследуемое вещество предварительно обрабатывается при невысокой температуре разбавленной серной кислотой в той же самой колбе, в которой будет произведено сжигание; после прекращения выделения углекислоты и продувания прибора чистым воздухом в колбу вносится в избытке бихромат и приливается через специально приспособленную воронку серная кислота концентрации 1 : 1 (но объему). Затем прибор медленно нагревается до кипения смеси. Выделяющиеся пары и газы проходят через конденсатор Геи- Люссака, наклоненный в обратную сторону, а потом'через три U-об- разные трубки, из которых первая наполнена хлористым кальцием, вторая — металлической сурьмой, третья — снова хлористым кальцием, после чего сухой углекислый газ поглощается едким кали в промывной склянке Гейслера.

В процессе работы я столкнулся со следующим затруднением: так как анализируемые мною растворы содержали значительные количества азотной кислоты, можно было опасаться, что вследствие ее неполной конденсации она будет поглощаться едким кали. Заменив первую трубку с хлористым кальцием промывной склянкой Либиха с 4%-ным раствором фенола в концентрированной серной кислоте, я убедился, что полностью устранил источник ошибок. Контрольные определения на подобным образом измененном приборе показали, что прибавление 2—3 г калиевой селитры к определенной навеске сахара не оказывает никакого влияния на результат анализа, точно так же как и присутствие одной селитры без сахара, как того требует методика.

Я внес еще небольшое изменение в прибор, заменив резиновую пробку стеклянной, плотно притертой к колбе и присоединенной без помощи каучуковых трубок к воронке и к конденсатору.

Многочисленные испытания метода показали, что при нем результаты оывают несколько ниже действительных; это обстоятельство делает их еще более надежными.

Для каждой культуры углерод определялся отдельно в осадке и в жидкости. Осадок карбонатов, обволакиваемый зооглеями, отделялся от культуральной жидкости фильтрованием через небольшой тампон из хорошо прокаленного асбеста.

Не придавая излишнего значения этим цифрам, я все же вижу в них доказательство того, что нитромонада обладает способностью ассимилировать углерод из углекислоты. Надеюсь, что в скором времени смогу сообщить более убедительные данные. Для этого потребуется провести аналогичные определения в более старых культурах, в которых непрерывно шла интенсивная нитрификация. Но уже теперь можно установить новый факт, имеющий первостепенное значение для физиологии: органическое вещество на земном шаре . образуется при жизнедеятельности живых существ не только в процессе фотосинтеза, но и в процессе хемосинтеза.

В итоге возбудитель нитрификации представляется мне обладающим примечательными свойствами, позволяющими рассматривать его как новый в науке физиологический тип. Свойства эти сводятся к следующему:

1)        развитие в чисто минеральной среде в присутствии неорганического вещества, способного окисляться;

2)        вся жизнедеятельность теснейшим образом связана с наличием этого вещества, каким в случае нитрификации является аммиак;

3)        окисление этого вещества является единственным источником, энергии;

4)        отсутствие потребности в органическом питании как в источнике пластического материала и энергии;

5)        неспособность разлагать органические вещества; их присутствие лишь тормозит развитие организмов;

6)        единственным источником углерода является ассимиляция углекислого газа в процессе хемосинтеза.

С полным основанием можно заметить, что совокупность вышеупомянутых свойств присуща не одной лишь нитромонаде и что открытые мною бактерии, окисляющие серу и яакисное железо, принадлежат к тому же физиологическому типу. Однако нитрификаторы являются исключительно благоприятными объектами для углубленного изучения этих физиологических свойств.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ