НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

К ИЗУЧЕНИЮ МОРФОЛОГИИ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ 

Настоящая статья является продолжением моих работ о нитрифицирующих организмах, опубликованных в «Анналах Пастеровского института» в продолжение двух последних лет. В предыдущих статьях рассматривались почти исключительно химическая и физиологическая стороны процесса, морфология же изучаемых организмов едва была затронута. Мне представляется не лишенным интереса дополнить уже имеющиеся сведения о нитрификации — важном естественном процессе — данными о морфологических особенностях ее возбудителен.

За последние два года изучению нитрификации было уделено большое внимание. Появившиеся в печати работы г-на и г-жи Франкланд, Уоринг- тона и мои дают в основном сходные сведения о биохимии явления. Однако область морфологии была представлена лишь краткими, зачастую противоречивыми описаниями активных организмов. Более того, данные английских авторов изобилуют ошибками, как это будет видно из последующего.

Описание нитрифицирующего микроба из минеральной культуры, данное Франкландами, близко к сделанному мною: это — овальные клетки, длиной в 1,2—1,8 [х, и шириной в 0,9—1 [х, встречающиеся поодиночке, парами или группами. Подвижных клеток упомянутые авторы не наблюдали.

Однако они сообщают, что им удалось культивировать микроб на обыкновенном щелочном бульоне и питательной желатине, и таким путем вызвать внезапные изменения в его форме. Бульон, засеянный чистой культурой микроба в минеральном растворе, изменялся очень медленно. Только через 20 дней (при обыкновенной температуре) он мутнел, на его поверхности появлялась пленка, а на дне — студенистый осадок. Под микроскопом эти разрастания оказались состоящими из тонких (0,5 ku) и длинных (5,7 |х) палочек. При посеве на питательной желатине вырастали маленькие бациллы, которые как бы являлись промежуточными формами между бациллами бульонных культур и минеральных растворов.

Уорингтон также культивировал этот микроб на различных средах: в растворах минеральных солей, на питательной желатине, в обычном мясном бульоне и в бульоне, разведенном водой, в молоке, разбавленной моче, растворах аспарагина и мочевины. По Уорингтону, микроб является в двух формах: первая из них представлена почти сферическими тельцами, величина которых изменяется от неизмеримо маленькой точки до 1 р. в диаметре. Эту форму можно найти во всех культурах; в молоке и в бульоне она — единственная. Вторая форма — та, которую обычно описывают как нитрифицирующий организм: овальные клетки, длиной несколько больше 1 [х.

Остается неясным, что представляет собой первая форма: описание, данное автором, не соответствует микроскопической картине культуры ни одного известного нам микрококка. На двух фотографиях, которые должны изображать рост этой формы в молоке и в бульоне, вместо очертаний микроорганизмов видны лишь маленькие точки.

Что же касается культуры в мясном бульоне, то Уорингтон не может подтвердить наблюдений Франкландов. Он сделал 24 опыта и ни разу не видел, чтобы бульон помутнел, сделался тягучим и дал слизистый осадок. Жидкость оставалась прозрачной, и в ней не появлялось никаких признаков роста. Точно так же Уорингтон никогда не находил тех бацилл и тонких нитей, о которых говорят Франкланды.

Из сделанного обзора видно, что в столь узкой области, как морфология примитивного организма, еще остается много неясностей. Какова же их причина? Ответить на это нетрудно.

Пока речь идет о культурах в минеральных растворах, все наблюдатели находят приблизительно одни и те же формы. Но как только начинаются попытки культивировать их в средах, содержащих органические вещества, данные исследователей расходятся. Франкланды отмечают одни превращения, Уорингтон — другие. Что же касается меня, то я вообще не обнаружил никаких превращений, потому что эти микробы отказываются расти на подобных средах. Приведенные факты вызывают сомнение в чистоте исследуемых культур и особенно остро дают почувствовать отсутствие средства контроля чистоты культур нитрифицирующих организмов.

Следовательно, необходимо попытаться найти такое средство, а также еще раз вернуться к наилучшим способам изолирования этих микробов. Наконец, нами будет изучен вопрос, тесно связанный с их морфологией, а именно: растут ли они в обыкновенных питательных средах и оказывают ли на органические вещества разлагающее и нитрифицирующее действие.

В настоящей статье затрагивается вопрос и об изучении характерных признаков нитритных и нитратных микробов различного происхождения. Имеем ли мы во всех случаях также специфическую функцию? Являются ли изучаемые формы идентичными или же, напротив, возникнет необходимость в выделении нескольких видов или штаммов, характеризующихся постоянством своих признаков?

Начнем с первого микроба, изученного мною,— с нитритного организма из цюрихской почвы. Проследим его рост в растворе минеральных солей, содержащем от 2 до 2,5 г сернокислого аммония на 1 л. Раствор помещают в плоскодонную коническую колбу в таком количестве, чтобы Н£»д осадком углекислого магния образовался слой, толщиной приблизительно в 1 см.

Через два дня нитритная реакция уже заметна; через 4—5 дней она становится интенсивной, однако в среде еще присутствуют значительные количества аммиака. Микроскопическое исследование культуры в этот момент часто не обнаруживает организмов, особенно если не знать точно, где их следует искать. Например, на поверхности жидкости они отсутствуют совершенно. Для их обнаружения надо взять со дна изогнутым платиновым ушком немного осадка и приготовить из него окрашенный препарат. При тщательном изучении препарата удается найти организмы среди частиц карбонатов. Микробы представляют собою либо «мелкие свободные клетки (табл. VI, фиг. 1 и 2), либо округлые тельца, то одиночные, то расположенные парами или группами, диаметр которых достигает нескольких десятков микронов. При осторожном окрашивании или, еще лучше, при исследовании подсушенного препарата в капле раствора иода удается рассмотреть структуру этих телец: они состоят из круглых или овальных клеток, соединенных без промежутков в очень компактную массу, иногда окруженную оболочкой, окрашивающейся значительно слабее клеточной массы (табл. VI, фиг. 6; табл. VII, фиг. 7 и 8; табл. VIII, фиг. 15).

На этой стадии развития клетки распределены в среде очень неравномерно; после посева они развиваются лишь в слое осадка магния, причем то тут, то там образуются скопления. Несмотря на это, окисление протекает довольно энергично, вызываемое, очевидно, этими компактными зооглеями.

В конце седьмого дня (а часто и позднее) жидкость, дотоле совершенно прозрачная, мутнеет; начавшись слабой опалесценцией, это помутнение через несколько часов становится отчетливым. Если сосуд находился в полном покое, легко заметить, что муть несколько больше у поверхности. Под микроскопом поверхностный слой оказывается кишащим подвижными клетками микроба, уже описанного в первой статье о нитрификации. Клетки эти движутся зачастую весьма энергично (табл. VI, фиг. 1—3).

Если в этот момент произвести повторное изучение осадка, то в нем удается обнаружить лишь остатки разрушенных скоплений, состоящие порой из более или менее рыхлых групп клеток.

Необходимо отметить, что в период образования подвижных клеток нитритная реакция всегда достигает своего максимума, однако в растворе еще имеется аммиак.

По прошествии 24—48 часов муть начинает исчезать и в то же время слой карбоната затягивается нежной пленкой; при легком покачивании сосуда на поверхности осадка возникают тонкие морщинки, и в конце концов весь осадок превращается в сероватые хлопья. Микроскопическое исследование осадка, обработанного кислотой, показывает, что бактерии одиночные или в небольших группах фиксируются на* частицах карбоната. После исчезновения аммиака жизнь в культуре останавливается и исследование больше не отмечает в ней никаких изменений.

Описанный ход развития микроба мы считаем типичным. Однако часто правильное чередование обеих стадий — колоний или компактных з о о - глей и свободных подвижных клеточек — монад — не происходит столь регулярно, а иногда и совсем не имеет места. Были получены культуры, состоящие исключительно из зооглеи или из монад. У первых жидкость над слоем карбоната всегда остается прозрачной, микробы находятся исключительно в форме довольно крупных зооглей, погруженных в осадок. Напротив, в культурах, изобилующих монадами, жидкость часто опалесцирует или мутнеет. Помутнение прекращается лишь после исчезновения аммиака и сразу возобновляется после его прибавления. При микроскопическом исследовании все клетки оказываются свободными и большей частью подвижными.

Некоторые образцы почв вызывают рост в форме зооглей, другие — в форме монад, причем характер их роста при пересевах остается постоянным в течение всех длительных серий. Кроме чисто морфологических особенностей, обе формы различаются также интенсивностью их действия, причем в этом отношении зооглеи оказываются менее активными, чем монады. Таким образом, есть основания считать их двумя самостоятельными видами нитритных микробов. Однако превращение зооглеи в свободные формы, подтверждаемое непосредственным наблюдением, противоречит этой точке зрения.

Каковы бы ни были истинные причины этих превращений, исследователю приходится считаться с наличием двух форм роста, вызывающих многочисленные отклонения в ходе опытов. Этим объясняются некоторые случаи медленного развития после пересевов, а также большие различия в интенсивности процессов в опытах, осуществляемых при совершенно одинаковых условиях.

Добавим, наконец, что большинство образцов почв, повидимому, содержит обе формы, которые нам еще не удалось окончательно разделить. Короче говоря, нам не удалось удостовериться в том, что мы имеем дело действительно с самостоятельными видами, а не с различными формами роста одного и того же вида .

Образование больших пакетов клеток, казалось, говорило о -том, что они делятся, подобно сарцинам, в трех направлениях пространства. У свободных клеток наблюдалось деление лишь в одном направлении.

Перехожу к культуре этого микроба на плотной среде.

Способ приготовления кремнекислого геля описан мною в статье IV. К четвертому дню культуры на пластинках появляются колонии, заметные при увеличении в 100 раз. Через 8 дней эти колонии достигают диаметра от 40 до 60 (х и приобретают бурую окраску. Колонии очень плотные, с резко очерченными контурами. Находящиеся на поверхности имеют округлую форму, погруженные в толщу среды — угловатую (табл. VIII, фиг. 13 и 14). Иные колонии столь плотны, что при прикосновении к ним острия нитевидного капилляра они, не распадаясь, погружаются в гель. Подобное строение делает их непригодными для отвивок, зачастую остающихся стерильными. Кроме темноо крашенных колоний на поверхности пластинок можно обнаружить свет л ы е, круглой формы и менее плотного строения (табл. VI, фиг. 5). Через 10—15 дней вокруг них появляется прозрачный ореол. Если теперь притронуться иглой к светлой колонии, она оказывается мягкой и липкой. Подобные колонии состоят из подвижных клеток.

И в этом случае способность клеток двигаться сохраняется недолго; через несколько часов они вновь переходят в состояние покоя.

По своей форме и структуре темные колонии не отличаются от зооглеи жидкой среды. Они изображены при различных увеличениях на фиг. 7, 8 табл. VII и фиг. 13, 15 табл. VIII (ср. со светлыми к о /I о н и я м !• на фиг. 5 табл. VI и фиг. 14 табл. VIII).

Итак, на твердой среде мы находим такие же формы микробов, что и на жидкой. В ней встречаются те же различия и неправильности, о которых мы говорили выше: иногда образуется больше темных коло- н и й, переход которых в светлые совершается медленно, неполно, а иногда и вовсе отсутствует. Подчас совсем молодые колонии разрушаются и переходят в светлые, сохраняя лишь маленькое темное ядрышко среди распадающейся массы.

Следует добавить, что жидкие культуры, в которых преобладают монады, образуют светлые колонии, тогда как культуры с преобладанием зооглей чаще всего дают начало темным ко л о н и я м.

Перейдем теперь к обзору других нитритных микробов, выделенных из образцов почв различных стран. Из каждого образца, как правило, удавалось выделить не более одного вида микробов, способных осуществлять нитрификацию.

Среди образцов, полученных мною из Франции, я тщательнее всего изучи7: один образец из Женнвилье, которым я обязан (как и многими другими) любезности г. Дюкло. В этой почве был найден микроб, полностью сходный с цюрихским. Правда, культуры последнего были всегда относительно богаты зооглеями и вызывали на кремнекислом геле появление темных колоний, в то время как в культуре микроба из Женнвилье муть почти не исчезала, и на геле встречались лишь светлые колонии свободных подвижных клеток.

Что же касается морфологии отдельных клеток штамма Женнвилье, то, сравнив фиг. 1 и 3 табл. VI, убеждаешься в отсутствии различия между ним и цюрихским штаммами. Весьма вероятно, что тот же самый биотип распространен и в других почвах Западной Европы.

Из образца почвы Восточной Европы (г. Казань, Россия) мы также выделили один штамм. От предыдущих он отличался вдвое меньшей величиной (ср. фиг. 4 табл. VI с фиг. 1 и 2 той же таблицы, снятые при одинаковом увеличении в 1000 раз). Этот отличительный признак оказался постоянным в течение всего периода наших наблюдений.

Не буду останавливаться на других образцах европейских почв, изучение которых не дало нам ничего нового.

иногда в обратном направлении. В последнем случае зооглеиизреживают- ся в центре, оставаясь еще довольно плотными на периферии (см. табл. VII, фиг. 11).

Подвижные клетки встречаются как поодиночке, так и небольшими подвижными группами, которые вращаются в жидкости.

Подвижные клетки снабжены непомерно длинным жгутом: в то время как диаметр самого кокка достигает всего 0,5 pi, его жгутик достигает 30 а и больше (см. табл.VII, фиг. 9 и 10). Эти формы хорошо окрашиваются по Лёффлеру. Каплю мутной жидкой культуры подсушивают на -покровном стекле, нагревают в концентрированном растворе ферротанната, в который на каждые 10 мл добавлено по 8 капель 1 %-ного раствора соды, отмывают водой, нагретой до 50°, быстро промыва!от спиртом, в который прибавлено несколько капель того же раствора соды (3 капли на 2—3 мл), и окрашивают фуксином в анилиновой воде. При применении этой сложной протравы жгутики приобретают отчетливую окраску. На первый взгляд они напоминают очень тонких спирохет.

Несмотря на такую длину жгута (а может быть именно из-за нее) кокки малоподвижны. Они медленно передвигаются, описывая волнистую линию, или, скорее, спираль с широкими витками. Европейская монада, обладающая очень коротким жгутиком, движется значительно быстрее.

При .культивировании на кремнекислом геле этот организм ведет себя точно так же, как микробы из Цюриха и Женнвилье. Отмечаются различия лишь второстепенного порядка: «темные колонии» бывают коричневатого оттенка или цвета кофе с молоком; при увеличении в 100 раз строение их кажется однородным, а не зернистым, как у европейского вида.

Я не обнаружил этого вида в образцах, полученных из Токио, в которых был найден овальный микроб, напоминавший цюрихский, но отличавшийся от него несколько меньшей величиной.

Четыро образца африканской почвы содержали нитритного микроба того же типа, характеризовавшегося овальной формой и несколько меньшими размерами. В почвах из JIa Регии я не мог обнаружить монад: жидкость оставалась все время прозрачной и содержала лишь круглые характерные зооглеи, не проявлявшие никаких тенденций к распаду. Любопытно, что нитрификация во всех четырех африканских сериях постоянно оставалась очень вялой. Различие между этими культурами и европейскими было даже поразительным: окисление одного и того же количества аммиака протекало в африканских культурах в 2—3 раза медленнее, чем в европейских. Эту медленность действия следует приписать, как и в других случаях, упорно зооглейному характеру роста.

В культуре микроба из Туниса мне лишь однажды удалось наблюдать опалесценцию и видеть подвижные формы, впрочем, в весьма незначительном количестве.

При изучении нескольких образцов почв Нового Света (Южной Америки и Австралии) я обнаружил существование нитритного микроба, коренным образом отличного по своим морфологическим признакам от ранее °писанных нами видов. К сожалению, мне не удалось завершить его изучение.

В культурах из почвы Квито я нашел только крупных кокков величиною от 1,5 до 1,7 (л в диаметре (см. табл. V, фиг. 2). В живом состоянии они Кажутся еще больше, чем на окрашенном препарате. В этих культурах я никогда не находил зооглей и не могу с уверенностью сказать, имеют ли ^и мегалококки подвижные стадии.

При культуре на кремнекислом геле они образуют относительно крупные колонии. Поверхностные колонии имеют вид мутных желтоватых капелек, всегда состоящих из свободных клеток.

 Точно такой же организм был мною найден в образце почвы из Кампи- наса (Бразилия). Он был еще несколько больше и достигал 2 jx. Во всех других отношениях описание его было бы повторением характеристики микроба из Квито.

Организм из мельбурнской почвы был идентичен двум предыдущим формам, отличаясь от них лишь несколько меньшими размерами.

Из сделанного мною обзора видно,»что процесс нитрификации в различных почвах осуществляется не одним и тем же видом, а несколькими видами, обладающими по существу идентичными функциями.

Насколько мне известно, нет сведений о том, содержит ли жизнеспособных нитритных микробов морская вода, взятая вдали от берегов. На земле их размножению препятствует большая чувствительность к высушиванию. Довольно значительные количества богатой организмами среды высушивались на фламбированных пластинках слюды и сохранялись в течение 10 дней в эксикаторе с хлористым кальцием, после чего пластинки опускались в обыкновенный аммиачный раствор. Нитрификации не происходило. Но после высушивания в течение суток на воздухе зооглеи вызывали нитрификацию, в то время как монады оставались неактивными.

Совершенно сухая, рассыпающаяся в пыль почва лишь редко содержит жизнеспособных нитритных микробов. В сухих комковатых образцах почв они встречаются в небольшом количестве.

В воздухе живые нитритные микробы всегда отсутствуют, судя по тому, что я никогда, в течение многих лет, не наблюдал самопроизвольной нитрификации в лабораторных условиях.

В вопросе о распространении нитритных микробов надо принять во внимание то, что, живя в очень различных почвах и климатах, эти виды должны были выработать известные приспособления к условиям среды. В результате местный вид окажется способным к существованию в условиях, неприемлемых для другого вида, происходящего из отдаленной местности. Например, вполне вероятно, что исключительно зооглейный характер роста нитрификаторов из почв Северной Африки мог явиться результатом происпособления к сухому климату. Наоборот, очевидно, что монады гораздо лучше приспособлены к условиям влажной почвы, богатой азотсодержащими органическими веществами, являющимися источником аммиака.

О нитратном микробе можно сказать лишь то, что он представляет собой маленькую палочку, суженную на одном конце (см. на табл. VIII, фиг. 16, воспроизводящую кусочек пленки, затягивающей дно сосуда с культурой данного микроба).

В петербургской почве эту форму обнаружить не удалось. Нитратный микроб, выделенный из нее, представлен мелкими кокками.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ