Свёртывание крови

Система PACK, помимо клеточных регуляторов (тромбоциты) г имеет гуморальные регуляторы, которые выполняют функцию» быстродействующих триггеров (пусковых механизмов), обеспечивающих различные реакции в системе PACK. С помощью этих реакций поддерживаются необходимые в данных условиях гемос-татические потенциалы крови. К таким регуляторам относятся: гепарин и антитромбин III.

Гепарин, впервые открытый в 1916 г. студентом-медиком McLean, используется в клинической практике как антикоагулянт в течение более 40 лет. Гепарин — наиболее широко применяемое средство немедленной антикоагуляции. В последние-годы значительно повысился интерес к изучению биохимии и механизма действия этого соединения. Выявлено взаимодействие-гепарина с антитромбином III, изучение этого вопроса позволило* лучше понять и механизм действия гепарина.

Наследственный дефицит антитромбина III — одно из немногих заболеваний, при котором тенденция к тромбозу может быть четко установлена биохимически. Более того, зависимость между антитромбином III и гепарином играет ключевую роль в понимании патогенеза и лечении тромбоэмболической болезни.

Антитромбин III

Несмотря на прогресс в области изучения антитромбинов, все? еще можно сказать, что факторы, способствующие свертыванию, изучены лучше, чем факторы, ингибирующие его. Очевидно, существуют мощные механизмы для нейтрализации активированных ввертывающих факторов, особенно тромбина.

Когда кровь свертывается in vitro, весь протромбин в норме превращается в тромбин и, если он не нейтрализован, количества тромбина, образованного из 10 мл крови, будет достаточно, чтобы свернуть весь фибриноген в организме. Эффективность действия антитромбинового механизма можно показать в простом эксперименте, в котором плазма свертывается под действием тканевого фактора и хлорида кальция и сгусток удаляется. Если затем в различные интервалы времени определить количество тромбина (измеряя концентрацию фибриногена), видно, что, хотя генерируется 300 ЕА тромбина на 1 мл плазмы, пик концентрации редко превышает 10 ЕА/мл и общая концентрация тромбина составляет лишь 10 % его потенциального количества.

Описано шесть различных типов антитромбина, но только первые три играют физиологическую роль [Lane J., Biggs R., 1977]. Термином «антитромбин III» первоначально обозначалась активность в плазме, которая вызывает необратимую деструкцию тромбина. Однако в настоящее время стало известно, что за эту активность ответственны по крайней мере три белка: си-антитрип--син, аг-макроглобулин (в основном это ингибиторы протаз) и а2-глобулин, который обладает наиболее специфичной антитромбиновой активностью, известной как антитромбин III. Показано, 'Что 50—75% общей антитромбиновой активности приходится на антитромбин III [Abilgaard U., 1967; Lane J. et al., 1975]; этот уровень может быть выше при снижении концентрации тромбина [Abilgaard U., 1975]. Международный комитет по тромбозу и гемостазу рекомендовал использовать термин «антитромбин III» для обозначения 0.2-глобулина   [Abilgaard U.,  1975].

Антитромбин I вызывает обратимое удаление тромбина из раствора путем адсорбции на фибрине [Klein H., Scegers W., 1950]. Хотя предполагать о таком механизме предупреждения распространения тромба и кажется привлекательным, но, вероятно, антитромбин I не так важен, как антитромбин III, поскольку антитромбин I удаляет из сгустка лишь небольшое количество тромбина [Seegers W., 1968] и дефибринированная плазма дает кривую генерации тромбина, сходную с таковой нормальной плазмы.

Антитромбин II — плазменный кофактор, необходимый для действия гепарина. Однако гепарин-кофакторная активность тесно ассоциирована с прогрессивной антитромбиновой активностью во многих тест-системах [Blomback M. et al., 1963; Biggs R. et al., 1976; 0degard O., Abilgaard U., 1977]. Abilgaard U. (1967) показал, что очищенный антитромбин III обладает гепарин-кофак-торной активностью. Это наблюдение подтверждено и другими авторами [Yin et al., 1971a; Rosenberg, Damus 1973]. При добавлении к антитромбину III специфических антител удаляется вся гепарии-кофакторная активность плазмы [Fagerhol, Abilgaard U., 1970; Rosenberg, Damus, 1973]. Накапливается большое количество доказательств в пользу того, что гепарин-кофактор идентичен антитромбину III. Таким образом, антитромбин III —главный ингибитор тромбина в плазме — является также плазменным белком, благодаря которому гепарин проявляет свое действие.

Показано также, что существует и второй кофактор гепарина, отличный от антитромбина III [Briginshaw, Shanberge, 1974], Однако он не был идентифицирован иммунологически и его белковый состав не расшифрован, поэтому мнение Porter и соавт. о наличии второго кофактора оспаривается [Yin et al., 1971; Abilgaard U., 1975].

Очистка антитромбина III. Антитромбин III был очищен Abilgaard U. (1967). Для этого автор использовал адсорбцию на А1(ОН)з, гельфильтра-цшо и ионообменную хроматографию. Лучшие из полученных препаратов имели специфическую активность, в 300 раз превышающую таковую в плазменном белке: с помощью дальнейшей очистки препаративным электрофорезом в полиакрилампдном геле активность была повышена в 700 раз [Abilgaard U. 1968].

Rosenberg и Damus (1973) описали сходный многоступенчатый процесс очистки, использование которого, однако, давало больший выход антитром-(шна III. Специфическая активность в их препаратах в 450 раз превышала активность в плазме.

Описаны методы очистки, основанные на связывании антитромбина III с гепарином [Miller-Andersson M. et al., 1977; Thaler, Sclimer, 1975]; выход специфической активности в конечном продукте в 500—700 раз превышал таковой из плазмы. Поскольку все эти препараты считаются гомогенными, различия в специфической активности могут быть обусловлены применением разных методик очистки. Однако не исключено, что по крайней мере некоторые из данных препаратов являются гетерогенными, так как при цммуноэлектрофорезе в присутствии гепарина нередко выявляются две популяции молекул. Исходя из приведенных выше показателей специфической активности, можно сказать, что концентрация антитромбина III и плазме составляет около 0,2 мг/мл.

Взаимодействие антитромбина III с тромбином. Антитромбин III реагирует с тромбином необратимо, образуя комплекс, в котором оба компонента инактивированы. Изучение кинетики этой реакции в плазме осложняется присутствием других ингибиторов тромбина. По данным, полученным многими авторами, кинетика л значительной степени обусловлена присутствием аг-макрогло-булина и, если его удалить добавлением к плазме риванола, оставшийся антитромбин III нейтрализует тромбин в биомолекуляр-пой реакции 2-го порядка.

Скорость реакции тромбин — антитромбин III зависит от концентрации реагентов. При концентрации антитромбина III, равной таковой в плазме, малые количества тромбина быстро разрушаются, но при разрушении больших количеств тромбина (500— 1000 ЕА) нередко требуется несколько часов, для того чтобы произошла нейтрализация [Seegers W. et al., 1952]. Если к плазме добавить 300 ЕА антитромбина III, нейтрализация тромбина происходит более чем за 1 ч [Klein H., Seegers W., 1950]. Возможно, что антитромбиновая система плазмы активируется ранними реакциями свертывающего процесса; если это так, то данный признак может найти применение при определении антитромбина III.

Mellanby в 1909 г. показал, что способность плазмы нейтрализовать тромбин в несколько раз превышает ее тромбин-генери-рующую активность: 1 мл плазмы способен нейтрализовать 750— 800 ЕА тромбина, что примерно в 3 раза выше ее тромбинового потенциала.

Используя очищенные компоненты, Rosenberg и Damns (1973) выявили, что тромбин и антитромбин III взаимодействуют в сте-хиометричетаком -соотношении 1 : 1, образуя -комплекс, имеющий молекулярную массу около 90 000 дальтон. Однако Binder (1973) при гельфильтрации не смог обнаружить этот комплекс в нормальной сыворотке, весь антитромбин III имел молекулярную массу около 190 000 дальтон. По данным Pepper и соавт. (1977), антитромбин III в сыворотке характеризуется большей молекулярной массой — 250 000 дальтон. Соотношение тромбина и антитромбина III в этом высокомолекулярном комплексе можно рассчитать, исходя из того факта, что их концентрация на 20— 30% меньше в сыворотке, чем в плазме крови [Heimburger, 1967; Biggs R. et al., 1970; Fagerhol, Abilgaard U., 1970]. Binder (1973) обнаружил, что 30% плазменного антитромбина III в сыворотке крови находится в комплексированном состоянии (ОД-ОД нмоль/мл). Поскольку одна молекула тромбина образуется на одну молекулу протромбина и 50% общего тромбина нейтрализуется антитромбином III, концентрация тромбина в комплексе должна быть равна 0,5 нмоль/мл, поэтому возможно, что соотношение тромбин: -антитромбин III поддерживается на уровне 1 :1.

Ингибирование активированных факторов свертывания антитромбином III. В 1962 г. W. Seegers и Marciniak установили, что» фактор Ха ингибируется фракцией бычьей плазмы, связанной с антитромбином III.

В последующем Yin и соавт. (1971а, Ь, с) изолировали ингибитор фактора Ха из кроличьей плазмы и доказали его идентичность с антитромбином III и кофактором гепарина. Авторы подсчитали, что одно и то же количество очищенного кроличьего ингибитора нейтрализует в 30—50 раз больше фактора Ха, чем тромбина (в соотношениях массы). В смеси бычьего фактора Ха и тромбина в соотношении 1 : 1—9 : 1 в тесте конкурентного ин-' гибирования Yin (1973) обнаружил преимущественное ингибирование Ха после 30-минутной инкубации с очищенным ингибитором человека. Однако U. Abilgaard (1978), используя очищенные реагенты человека, показал, что тромбин в смеси ингибируется гораздо быстрее, чем фактор Ха. Это, вероятно, сходно с ситуацией, наблюдающейся при нормальном свертывании, когда уровень генерируемого тромбина примерно в 100 раз больше количества фактора Ха, и они оба нейтрализуются в течение 15 мин свертывания. Не вызывает сомнения, что наиболее важное значение имеет изменение скорости нейтрализации. В этой связи существуют два соображения. Большая часть экспериментальных данных касается нейтрализации добавленного фактора Ха в свободных растворах. Однако известно, что если фактор Ха связан с тромбоцитами, фактор V — с фосфолипидным комплексом или одним фосфолипидом, то он в значительной мере защищен от инактивации анти-Ха [Yin, 1975]. Jackson (1976) полагает, что после того, как тромбин высвобождается из протромбин-актива-торного комплекса, фактор Ха остается присоединенным к фос-фолипидной поверхности и превращает больше протромбина. Возможно, что этот защитный механизм существует для того, чтобы обеспечить полное превращение протромбина в тромбин перед тем, как фактор Ха высвободится и нейтрализуется.

Второй важный момент в анти-Ха-активности антитромбина III — фактор Ха человека нейтрализуется гораздо медленнее, чем бычий фактор Ха [Biggs R. et al., 1970; Marciniak, Tsukamu-ra, 1972]. Marciniak и Tsukarnura показали, что при наличии в плазме фактора Ха в количестве, эквивалентном 0,5% плазменного потенциала, требуется более 1 ч для удаления этого фактора. При нормальной коагуляции именно это количество нейтрализуется за 15 мин. Это аналогично такой ситуации, при которой образуемый в организме тромбин нейтрализуется более быстро, чем экзогенно добавленный тромбин. Таким образом подтверждается возможность того, что ингибиторная система включается ранними реакциями свертывающего каскада.

Аититромбин III, очищенный Yin и соавт. (1971), не ингиби-ровал факторы Х1а и ХИа. Однако, поскольку этот препарат готовили из кроличьей плазмы, он мог обладать специфическими свойствами. Damus и соавт. (1973) показали, что антитромбин III человека способен нейтрализовать не только тромбин и фактор Ха, но и факторы IXa, XIa, а также плазмин.

Наиболее важным в этих экспериментах является то, что скорость ингибирования всех этих активированных факторов значительно повышается при добавлении гепарина. Это объясняет широкий спектр действия гепарина как антикоагулянта и подчеркивает важность скорости ингибирования данных активированных факторов для предупреждения тромбоза.

Определение аититромбина III. Определение антитромбина III основано на изучении его способности нейтрализовать тромбин или фактор Ха в присутствии и в отсутствие гепарина. Это не означает, конечно, что все яти функции связаны с одним и тем же активным центром в молекуле. Действительно, Rosenberg ж Damus (1973) показали, что гепаринсвязываю-щая детерминанта (главным образом, лизиновые остатки) может быть блокирована без воздействия на тромбиннейтрализующий центр. О. 0de-gard и соавт. (1976) показали, что в отсутствие гепарина отмечается слабая корреляция между антитромбиновой и анти-Ха-активностью.

При  определении  антитромбина  III   в  плазме  постоянные  количества тромбина и фактора Ха добавляют к плазме  в различных разведениях, и после определенного периода инкубации измеряют остаточную концентрацию фермента. В присутствии гепарина реакция заканчивается быстро, но без него концентрация антитромбина III может быть определена либо по начальной скорости [Abilgaard U. et al. 1970], либо по общему количеству нейтрализованного продукта. Первое более релевантно концепции о том, что изменение активности антлтромбина III предрасполагает к тром'бозу. Однако используемые в различных тестах экспериментальные условия варьируют в отношении как времени инкубации, так и количества используемого тромбина или фактора Ха и метода дефибринации (для снижения действия антитромбина I). Обзор различных методов представлен в работе J. Lane и R. Biggs (1977).

Применение синтетических субстратов для тромбина и фактора Ха вносит дополнительные вариации в результаты тестирования, поэтому необходимо одни и те же пробы анализировать комплексом различных методов. Такое исследование было организовано Международным комитетом по тромбозу и гемостазу. Антитромбин III можно определять также с помощью иммунологических методов, но при этом можно получить ошибочные результаты из-за присутствия аномальных молекул [Sas G. et al., 1974] или антигенности комплекса антитромбин Ш-тромбин fAndersson L et al., 1977].

Антитромбин III и болезни. Тромбофгошя, вызванная наследственным дефицитом антитромбина III, впервые наблюдалась в норвежской семье Egeberg (1965). К настоящему времени опубликованы и другие сообщения о семьях с подобным дефектом [Marciniak et al., 1974; Sas G. et al., 1974; Lectmer K. et al., 1977]. Очевидно, что заболевание наследуется по аутосомально-домииантному типу.

Клинически заболевание проявляется в виде повторяющихся эпизодов венозных тромбоэмболии, начинающихся обычно в сравнительно молодом возрасте. У членов одной семьи, описанной G. Sas и соавт. (1974), уровень антитромбина III, измеренный с помощью иммунологического метода, оказался нормальным, хотя свертывающая активность была значительно снижена. Это свидетельствует о том, что дефект в данной семье был качественным: дефектный антитромбин III, будучи неактивным в отношении свертывания, в антигенном отношении был сходен с нормальным белком. Наоборот, у больных с наследственным дефицитом антитромбина III, описанных Leclmer К. et al. (1977), отмечалась хорошая корреляция между уровнем этого белка, определяемым иммунологически, и в тестах на активность. По-видимому, у большинства больных с наследственным дефицитом антитромбина III содержание иммунореактивного антитромбина III снижено в той же степени, как и биологическая активность.

Имеется большое число сообщений об уменьшении концентрации антитромбина III при различных заболеваниях: остром венозном тромбозе [Leclmer К. et al., 1977; Arco F. et al, 1979], патологии печени [Duckert F., 1973; Damus P., Wallace G., 1975], ДВС [Abilgaard U. et al, 1970; Ramus P., Wallace G., 1975], в послеоперационном периоде [Ahlberg A. et al, 1973] и у женщин, принимающих контрацептивы    [Kaulla E., Kaulla К. N.,  1970]..

В какой степени эти данные отражают причинную зависимость между дефицитом антитромбина III и тромбозом, остается неясным. Почему у больных с уровнем антитромбина III 40—60% развивается тромбоз, неизвестно. Предполагают, что организму требуется близкое к нормальному количество антитромбина III для противодействия внутрисосудистому свертыванию. В любом случае уровень ниже 80%, по-видимому, связан с тенденцией к венозному тромбозу, особенно после травмы или оперативных вмешательств.

У 290 больных с тромбозом глубоких вен или легочными эмбо-лиями К. Leclmer и соавт. (1977) обнаружили значительное снижение по сравнению с нормой концентрации антитромбина III. К сожалению, разница между здоровыми лицами и больными была такова, что, хотя различия в целой группе и 'были статистически достоверными, только у 27 (7%) больных обнаружен уровень антитромбина III ниже двух стандартных отклонений от средней величины (менее 78%). Поэтому определение антитромбина III у отдельных больных вряд ли целесообразно. Однако W. Sagar и соавт. (1976) при проспективном обследовании 35 больных, оперированных на бедре, обнаружили следующее. У 23 пациентов после операции не было тромбоза глубоких вен, но у них выявлена «предоперационная» активность антитромбина III, в среднем равная 100%. У 12 человек, у которых после операции развился тромбоз глубоких вен, средний «предоперационный» уровень антитромбина III был равен 79%, у 5 из них этот показатель оказался ниже 70%; у всех этих больных в последующем развился тромбоз глубоких вен.

По-видимому, у больных, подвергаемых большим оперативным вмешательствам, уровень антитромбина III менее 80% надо рассматривать как фактор риска развития послеоперационного тромбоза глубоких вен.

У больных с дефицитом антитромбииа III, либо -наследственным, либо приобретенным, тенденция к тромбозу может контролироваться антикоагулянтной терапией. Больным с наследственным дефицитом рекомендуется длительное применение per os^_aH-тикоагулянтов кумариновой группы [Leclmer К. et al, 1977], тогда как у больных с низкой активностью антитромбина III, подвергаемых оперативному лечению, целесообразнее кратковременное применение низких доз гепарина подкожно.

По данным W. Sagar и соавт. (1976), у женщин со сниженной активностью антитромбина III, принимавших per os контрацептивы, малые дозы гепарина предупреждали дальнейшее уменьшение концентрации антитромбина III во время операций. В настоящее время имеется возможность применять препарат очищенного антитромбина III у больных с дефицитом этого белка. Однако пока нет единого мнения о полезности клинического применения замещающей терапии антитромбином III при дефиците данного фактора.

Гепарин

Химическая характеристика гепарина, насколько она известна в настоящее время, суммирована S. Kiss (1975). Гепарины — группа анионных полисахаридов с прямой цепью (эфир глюко-зоаминоглюкуронан-сульфата — ГАГС), обладающих различной молекулярной массой — от 9000 до 15 000 дальтон (существуют формы с массой 4000—40 000 дальтон). Мнение, что гепарины представляют собой смесь из 21 молекулы, дискутируется [Johnson S., Mulloy, 1976; Righetti, Gianazza, 1978].

Наиболее существенное свойство гепарина, отличающее его от других ГАГС, — это большая степень сульфатации: около 2— 2,5 сульфатного иона на единицу дисахарида (у других ГАГС — один ион или, например, для гиалуроновой кислоты —- ни одного). Однако известно, что при сульфатации ГАГС в лабораторных условиях никогда не получается продукт с более или менее выраженной антикоагулянтной активностью гепарина (in vitro). В настоящее время уже ясно, что специфические, свойства, которыми обладает только гепарин, обусловлены специфическими структурными особенностями [Engelberg И., 1977; Shilely J., Cancad H., 1977]. Очевидно в полисахаридной цепи имеются последовательности, которые связаны с белковым кофактором и активируют его (или вероятно инактивируют), изменяя конфигурацию этого кофактора. Возможно, что существует несколько различных последовательностей, и все они способны вызывать конформационные изменения, хотя и различной выраженности, с различной константой связывания.

Гетерогенность гепарина не артефакт препаративного происхождения, а зависит от особенностей биосинтетического процесса [Cifonelli J., 1974]. Гепарины из различных тканей отличаются друг от друга [Cifonelli J., King J., 1970]. Эти различия скорее относительны, чем абсолютны, — отдельные молекулярные образцы могут присутствовать и в легких, и в слизистых оболочках [Lasker.M., 1977]. На основе различий, наблюдаемых в спектре цротоно-магнитного резонанса, A. Perlin (1977) подразделяет коммерческие препараты гепаринов на два класса — А и В, соответствующие гепаринам слизистой оболочки свиньи желудка (А) и легкого быка (В). Гепарины класса А содержат N-ацетиловых групп гораздо больше, чем гепарины класса В. Существуют и другие, пока не идентифицированные отличия.

Конформацию молекул гепаринов в растворах изучали с помощью оптических методов [Stone A., 1977], а в твердом состоянии — с помощью Х-лучевой кристаллографии при использовании ориентированных пленок [Atkins E., Nieduszynski L, 1977]. В плазме, однако, гепарин полностью связан с белками или посредством прямого электростатического взаимодействия с соответственно ориентированными основными аминокислотными остатками, или другими, нековалентными, механизмами [Lari-rent L., 1977], и его конформация контролируется такими взаимодействиями.

Тесты на гепарин. Методы определения гепарина дают даже более вариабельные результаты, чем методы определения антитромбина III [Brozovic, Bangliam, 1975]. Почти каждый свертывающий тест служит для измерения активности гепарина и большинство этих методов не основаны на современных данных о механизме действия гепарина. Как и можно было ожвдать для такого гетерогенного вещества, различные методы дают различные результаты при исследовании одного и того же   образца.

Наиболее значительное достижение последних лет — введение в практику более специфичного теста, основанного на способности гепарина ускорять нейтрализацию фактора Ха [Yin et al., 1973; Denson S., Bonnar O., 1975]. Этот метод теоретически обоснован и гораздо более чувствителен, чем другие антикоагулянтные тесты, что делает его пригодным для клинического применения. Однако из-за больших различий между результатами, получаемыми с помощью этого и других методов [Barrowcliffe Т. et al., 1978] очевидно, что тест на анти-Ха измеряет только один, хотя, может быть, и наиболее важный аспект общей антикоагулянтной активности гепарина. Знания о поведении гепарина в различных тест-системах на молекулярном уровне пока еще ограничены.

Механизм действия. Известно, что для проявления антикоагулянтной активности гепарина требуется плазменный кофактор. Гепарин ускоряет нейтрализацию тромбина, не влияя на количество нейтрализованного продукта. Гепарин действует также на ранние реакции свертывающего каскада, и то, что он ускоряет нейтрализацию антитромбином III факторов IXa, XIa, Ха и тромбина [Rosenberg M., Damus J., 1973], подтверждает единый механизм этих многих сторон антикоагулянтного действия гепарина. При адсорбции гепарина на связанном с матриксом антитромбином III получаются «активные» (адсорбированные) и «неактивные» (слабо адсорбированные или совсем не адсорбированные) фракции. Это служит убедительным доказательством того, что связывание антитромбина III — первое условие для проявления антикоагулянтной активности гепарина [Feinman R., Li E., 1977; Riesenfeld J. et al., 1977]. M. Rosenberg и J. Damus (1973) предполагают, что гепарин связывается с лизинговыми остатками молекулы антитромбина III, вызывая конформационные изменения и делая его активный центр более доступным для серинпротеаз. Кинетика этой реакции была изучена Е. Einarsson (1976) и Е. Einarsson и L. Andersson (1*977) с помощью физико-химических методов; конформационные изменения наблюдали также G. Villanueva и I. Danichefsky (1977). Однако имеются доказательства, что механизм неодинаков для всех серинпротеаз.

R. Biggs и соавт. (1970) показали, что механизм усиления гепарином ингибирования фактора Ха отличается от ускорения под действием гепарина нейтрализации тромбина. Гепарин вызывает более прогрессивное ингибирование фактора Ха, линейное со временем, тогда как его действие на тромбин заключается в быстром увеличении начальной скорости ингибирования. Количество гепарина, необходимое для ингибирования фактора Ха, также оказалось значительно меньшим, чем для нейтрализации тромбина. Антикоагулянтная активность фракций гепарина тоже свидетельствует о различных механизмах; низкомолекулярные (менее 6000 дальтон) фракции меньше влияют на нейтрализацию тромбина, но обладают более высокой анти-Ха-активностыо, а высокомолекулярные фракции (более 25 000 дальтон) оказывают противоположное действие  [Andersson L. et al., 1976].

Гепарин прямо реагирует с тромбином, хотя Gitel (1975) я показал, что связывание гепарина с тромбином менее сильное, чем гепарина с антитромбином III. Обнаружено также, что фактор Ха слабо связан с гепарином. Эта прямая реакция между гепарином и тромбином осложняет изучение взаимодействия гепарин— тромбин — антитромбин III, поэтому предложена альтернативная гипотеза, согласно которой гепарин связывается с тромбином, делая последний более доступным для нейтрализации антитромбином III. Однако ни тромбин, ни фактор Ха не присутствуют в нормальной плазме и вводимый гепарин связывается почти исключительно с антитромбином III, поскольку в плазме нет других белков, которые могли бы эффективно с ним комплек-сироваться. При концентрации гепарина 1ЕД/мл на одну его молекулу приходится еще около трех молекул антитромбина III. По данным С. Machovich (1975), блокирование аргининового центра тромбина, ответственного за связывание гепарина, не влияет на фибршюгенную активность тромбина, его одного или в присутствии избытка антитромбина III (медленная инактивация), но очень резко снижает ускоряющее действие гепарина на инактивацию антитромбина III.

G. Smith (1977) показал, что в системах с использованием физиологических концентраций предварительная инкубация с антитромбином III не оказывает никакого действия, если гепарин в смеси с синтетическим субстратом в последующем связывался с тромбином. Однако в отличие   от других   исследователей,   в том числе и Machovich, автор не обнаружил ингибирования тром-бинамидазной активности одним антитромбином III. E. Li и соавт. (1974) и G. Smith (1977) нашли более высокие связывающие константы для гепарин-тромбинового взаимодействия, чем те, которые описаны для системы гепарин — антитромбин III. Возможно поэтому, что, хотя антитромбин III и может быть носителем гепарина в плазме, начальным следствием столкновения с тромбином может быть перенос гепарина, ускоряющий скорее активацию тромбина, чем антитромбина III.

Сложность такого механизма заключается в том, что активация тромбина гепарином должна также активировать его для нормального субстрата, если антитромбин III рассматривать как суб-стратконкурентный ингибитор [Seegers W., 1975]. Большинство авторов, однако, нашли, что гепарин один ннгибирует действие тромбина на фибриноген. Нет нцкаких подтверждений механизма переноса гепарина в работе Е. Li и соавт. (1976). Возможно, что более верной является комбинация этих двух концепций: гепарин участвует в реакции с тромбином и антитромбином III. Это может объяснить увеличение специфической активности (на 1 моль) при повышении молекулярной массы {Horner A., 1977; Barrowcliffe Т. et al., 1978]: крупные молекулы легче связываются и с тромбином, н с антитромбином III. Количество гепарина, необходимое для акцелераторного действия, очень низкое. Увеличение скорости нейтрализации гепарина отмечается при его концентрации, равной 0,02 ЕД/мл [Biggs R. et al., 1970]. При этой концентрации на каждую молекулу гепарина приходится 150 молекул антитромбина III, что подтверждает каталитический эффект.

Gitel (1975) предполагает, что гепарин, высвободившись однажды, образует комплекс тромбин ■— антитромбин III. Показано [Andersson L. et.al., 1977], что такой комплекс связывает гепарин очень слабо. Усиливая ингибирование фактора Ха, гепарин способен- предупреждать образование гораздо больших количеств тромбина, чем может быть непосредственно нейтрализовано [Wessler S., Yin I., 1974]. Это действие минимальных количеств гепарина на нейтрализацию фактора Ха создает рациональную теоретическую основу для повышения эффективности профилактики гепарином венозных тромбоэмболии.

Клиническое применение гепарина. В клинике гепарин применяют тремя основными способами (1) в низких дозах, в виде подкожных инъекций — для профилактики венозных тромбозов; (2) в стандартной дозе, внутривенно — для лечения явного тром-боза; (3) в качестве антикоагулянта для поддержания жидкого состояния крови при экстракорпоральном кровообращении (аппараты сердце — легкое, гемодиализа).

Важно различать цель, с которой используется гепарин терапевтически: различную роль гепарина при профилактике и лечении болезни можно лучше понять, учитывая центральную роль тромбина.

Когда гепарин используют с профилактической целью, о генерации тромбина свидетельствует вызываемое гепарином увеличение активности антитромбина III. Снижение активности фактора Ха гепарином — антитромбином III, вероятно, для профилактики более важно, чем способность антитромбина III нейтрали-зовывать тромбин, поскольку фактор Ха потенциально более тромбогенен, чем сам тромбин [Yin I. et al., 1971]. Однако при ■ явном тромбозе необходимо не только нейтрализовать уже образовавшийся тромбин, но и предупредить дальнейшее его образование. Лабораторные и клинические исследования показали, что для лечения тромбоза требуется по крайней мере в 2 раза больше гепарина, чем для профилактики этого заболевания. Например, эффективной дозой для профилактики тромбоза глубоких вен является 10 000—15 000 ЕД в день подкожно (в несколько приемов), для лечения развившегося венозного тромбоза и эмболии тре- . буется по крайней мере 25 000—30 000 ЕД в день, внутривенно [Thomas J., 1976].

Одним из препятствий для клинического применения гепарина являются геморрагические осложнения. Даже при использовании низких доз для предупреждения послеоперационного тромбоза глубоких вен в области послеоперационной раны довольно часто появляются гематомы [International Multicentre Trial, 1975].

При назначении гепарина внутривенно в полной дозе частота геморрагии 'составляет примерно 10% [Salzman Е,, et al., 1975; Mant I. et al., 1977], поэтому значительный интерес представляют любые исследования, направленные на снижение опасности геморрагии и повышение терапевтической ценности гепарина. Фракционирование гепарина может привести к повышению эффективности его действия, по крайней мере для профилактики. В опытах in vitro, а также в фармакологических экспериментах на добровольцах показано, что низкомолекулярные фракции гепарина специфически повышают нейтрализацию фактора Ха и оказывают меньшее влияние на общую свертывающую активность, чем цельные препараты [Andersson L. et al., 1976; Bar-rowcliffe T et al., 1978]. Эффективность терапии малыми дозами гепарина зависит от повышения собственных защитных реакций организма, направленных против генерации тромбина в результате увеличения скорости нейтрализации фактора Ха [Wessler S., 1977]. Целесообразно было бы поэтому применять те фракции гепарина, которые оказывают наибольшее антн-Ха-дейст-вие и минимально влияют на общую свертывающую активность.

Эти соображения не имеют значения в том случае, когда тромбин уже образовался и при развившемся тромбозе. Однако эффективность низкомолекулярных фракций гепарина в предупреждении венозного тромбоза без геморрагических осложнений необходимо еще доказать в клинических исследованиях.

Неожиданным явилось сообщение С. Marciniak и I. Gockerman [(1977), которые наблюдали у 26 больных, получавших гепарин внутривенно, снижение уровня циркулирующего антитромбина III. У всех больных терапия гепарином сопровождалась прогрессирующим снижением и антитромбин-Ш-связывающей способности, и уровня антигенного белка. Концентрация антитромбина III в плазме нормализовалась через несколько дней после прекращения введения гепарина. Эти наблюдения, которые авторы никак не объясняют, не касаются больных, получавших низкие дозы гепарина. Действительно, гепарин должен циркулировать в крови длительное время, чтобы снизить концентрацию антитром-бпна III в плазме. Авторы учитывают возможность того, что само тромбоэмболпческое заболевание может быть «ответственно» за снижение уровня антитромбина III, главным образом из-за постоянства и величины редукции этого белка у всех больных, которые получали стандартную терапию гепарином, и отсутствия зависимости эффекта от локализации и степени тромботических: проявлений. Если эти наблюдения подтвердятся, может быть придется модифицировать стандартный режим терапии гепарином при тромбоэмболической болезни таким образом, чтобы свести до минимума подавление активности антитромбина III.

Данные С. Marciniak и I. Gockerman согласуются с наблюдениями J. Collen и соавт. (1977), которые обнаружили нормальный кругооборот меченого антитромбина III у 3 больных с венозным тромбозом, не получавших гепарин. Однако у 3 других пациентов с этим же заболеванием и лечившихся гепарином, полупериод жизни меченого антитромбина III в плазме был значительно сокращен, а скорость катаболизма повышена. Авторы сделали вывод о том, что в этих случаях имеет место более высокий метаболизм комплекса антитромбин III — гепарин.

Значение антитромбина III как естественного защищающего от тромбоза компонента подтверждается частотой венозных тромбоэмболии у больных с наследственным дефицитом антитромбина III. В настоящее время считают, что основным механизмом действия гепарина является потенцирование действия антитромбина III и способность комплекса антитромбин III — гепарин быстро инактивировать большую часть серинпротеаз свертывающей системы крови.

Биологическим следствием гетерогенности гепарина является различное действие на антитромбин III гепаринов, полученных из разных тканей, и фракций гепарина с различной молекулярной массой. Появилась возможность использовать эти различия для повышения терапевтической эффективности гепарина.