|
|
С помощью микроскопа в препарате
из анализируемого субстрата подсчитывают количество видимых клеток, как
мертвых, так и живых, Этот метод простой, позволяет быстро получить
результаты, а следовательно, оценить исследуемый образец. Недостатком метода
является-невозможность отличить живые'клетки от мертвых; нельзя полулить
микробы в виде культур и исследовать их свойства; следовательно, при
непосредственном подсчете невозможно осуществлять качественное исследование
микроорганизмов.
Существует несколько вариантов метода непосредственного
подсчета микробов под, микроскопом. При некоторых из них, например подсчете в
камера, учитывают клетки непосредственно в жидкости; в других, например
методе Брида, Дрейера — Королева, -микроскопируют высушенный, фиксированный и
окрашенный препарат. Имеется также вариант (м'етод микрокультур),
представляющий как бы сочетание метода непосредственного подсчета микробов с
методом культивирования.
Подсчет клеток в счетной камере. Счетная камера
представляет собой толстое предметное стекло, в середине которого находится
плоское углубление; расстояние от его дна до нижней поверхности покровного
стекла, плотно наложенного па края впадины, равно 0,1 мм. В центре -дна счетной камеры нанесена квадратная сетка общей площадью 1 мм2, состоящая из 400
квадратиков (20X20). При величине элементарного квадратика 1/х мм2, толщине
слоя (глу
|на камеры) 0,1 мл объем каждого столбика жидкости,
располо?нного на элементарном квадратике, равен 'Доd мм3, или Г4000000 мл.
Небольшую каплю исследуемой жидкости, предварительно тша1ьно
взболтанной, вносят петлей в центр камеры и покрывают кровным стеклом, с
которым капля должна соприкасаться верх|й поверхностью. Покровное стекло
слегка нажимают возЛё краеп I немного передвигают до тех пор, пока не будет
достигнуто полное вприкоснопение. Камеру устанавливают на столик микроскопа,
освляют на несколько минут в покое, пока все клетки не осядут на o, и
устанавливают систему микроскопа так, чтобы было вадно [четливое изображение
основной сетки камеры и исследуемых кле(дрожжей или бактерий).
Подсчитав количество клеток в нескольких квадратиках, нахо|т
среднее число клеток для одного квадратика. Если в среднем один квадратик
приходится 2 клетки, то в 1 мл будет находиться 1-106=8-106 клеток. Метод
Брнда. Точно калиброванной пипеткой 0,01 мл исследуежндкости помещают на
предметное стекло и равномерно расселяют профламбированной иглой на площади 1
см2. Мазок высушивают, обезжиривают, фиксируют и окрашивают. Для
одновременного обезжиривания, фиксирования и окрашншя препарата рекомендуется
следующий состаз раствора: спирт :олютный) — 50 мл, хлороформ — 50, ледяная
уксусная кисло— 20 мл, фуксин основной — 0,1 г, метилановый голубой — 1,0 г. Спирт предварительно обезвоживают желатином. Краски рас[оряют в
смеси спирта и хлороформа, нагретой до 50°С. После ох!ждения до комнатной
температуры в раствор добавляют ледяную кусную кислоту.
Препарат готовят обычным способом и высушивают на воздухе
подогрева и фиксации на пламени. Затем его обезжиривают, спругот и
окрашивают, дважды погружая в указанный выше' рас(первый раз на 5 с, второй —
на 10 с). Бактериальные клетки !шпваются в синевато-голубой цвет и четко
-выделяются на о-розовом фоне. Клетки подсчитывают, пользуясь иммерсиопобъективом,
в определенном количестве типичных полей зрения тем вычисления определяют
среднее количество бактерий в од|поле зрения.
Для подсчета бактерий в 1 мл среднее количество-бактерии в
зрения микроскопа умножают на коэффициент 10000/3.14 (z-2). _/с поля зрения
(г) определяют путем измерения диаметра поля |пя. Коэффициент остается
постоянным до тех пор, пока не из|тся объектив, положение тубуса и окуляр
микроскопа. 1ри непосредственном подсчете бактерий под микроскопом регаты
будут несколько завышенными но сравнению с чашечным рдом, так как учитывают и
живые, и мертвые клетки. В то же [я простота и доступность этого метода для
практического прикшя, а такке быстрота получения результатов делают этот
метод |ым и весьма перспективным, количество клеток в прозрачных питательных
средах можно опiflb с помощью ФЭКа. Для этого строят калибровочную кривую,
Ькающую зависимость между количеством клеток в среде и мутio среды. При
определении содержания микроорганизмов в среде авялвается мутность на ФЭКе, а
затеи по калибровочной кри)ассчитыв'ают число микроорганизмов в образце.
|