|
|
Для определения содержания или
обнаружения антибиотиков в молоке применяются косвенные и прямые методы, (
При косвенных методах больному животному вводят препараты ибиотиков,
содержащие красящие вещества, которые вместе с нбиотиками выделяются из
вымени в молоко и придают ему хатериый цвет. К красителям предъявляются
следующие требова: обладать такой же стойкостью, как и антибиотики; не быть
витыми ни для людей, ни для животных; выделяться вместе с оком с той же скоростью,
что и антибиотик; обладать такой краей способностью, чтобы легко
обнаруживаться даже при больразведениях; не оказывать отрицательного действия
на антитик.
В качестве красящих веществ используют хлорофилл, флюорес,
краску зеленый BS (мононатриевая соль 4-4-ди-2-гидроксидисульфонафтилкарбонилангидрида).
Прямые методы можно разделить на химические и микробиолоеские. Химические
методы специфичны, но недостаточно чувстёльны. Наиболее совершенные
химические методы позволяют еделить около 0,1 ИЕ/мл пенициллина. Кроме того,
они длительтрудоемки и не могут использоваться для ежедневного контромолока.
Микробиологические методы более чувствительны и позволяют
еделить антибиотики в концентрациях, задерживающих развитие роорганизмов.
Сущность микробиологических методов сводится к
установлению влияния антибиотиков на развитие микроорганизмов, их
биохимическую активность и морфологию. Ингибировать развитие микроорганизмов,
в молоке могут не только антибиотики, но и термолабильные естественные
ингибиторы, содержащиеся в молоке, бактериофаги. Чтобы исключить влияние этих
факторов на результаты пробы, рекомендуется предварительное прогревачше
исследуемых образцов молока до 80—95°С в течение 2—10 мин. Однако помимо
вышеназванных ингибиторов в молоко попадают или вносятся в целях
фальсификации (для задержки .нарастания кислотности) различные дезинфицирующие
и консервирующие вещества,' которые не разрушаются при прогревании образцов
молока. Поэтому с помощью микробиологических методов определяют -наличие в
молоке не только антибиотиков, но-и термостойких иигиб'ирующих вёществ в
целом. Разработанные для обнаружения в молоке пенициллина и других
ингибйрующих веществ микробиологическрю методы основаны на ин'гибирующем
действии исследуемого молока по отношению к определенным тестгкультурам.
Чашечный метод — нанесение пробы в виде полосок, цилиндров и сквозных
отверстий; проба на сквашивание — изменение способности к сквашиваниюили
окислительновосстановительного потенциала в соответствующей тёст-культуре.
Комбинирование теста на сквашивание с применением
окислительно-восстановйтельных индикаторов (метиленового голубого,
резазурина, брршлиаитового черного или трифёнрштетразолий хлористого) — в
настоящее время наиболее пригодные для практики методы. В результате
торможения роста бактерий замедляется изменение
окислитёльно-восстаиовительногопотенциала и, следовательно, изменение цвета
индикатора. '
При наличии в молоке ингнбнх веществ содсржымое пробирок
будет иметь голубой цвет, пределен не ингибирующих веществ с бром о л
пурпуром. Для определения ингибирующих веществ методом используется набор, в
который входят: ампулы, сощие В. searohermophilus var. calidobacis в плотной
среде:
питательные таблетки, содержащие пептон, глюкозу, сухое
молоко и индикатор (бромкрезолпурпур); шприцы для отбора молока, пипетки.
Перед проведением анализа вскрывают ампулы и специальны
шприцем вносят в них по 0,1 мл исследуемого, молока и по одной питательной
таблетке с индикатороыг. Затем ампулы помещают на водяную баню, в которой
Поддерживают температуру 64±2°С, и выдерживают при этой температуре в
течение-2,5 ч? После этого ампулы вынимают из водяной'бани и отмечают цвет
мо'локач в них. Если цвет молока остается сйреневым, значит, в молоке
содержатся антибиотики (в количествах, указанных ниже), . желтый цвет
свидетельствует об отсутствии антибиотиков в молоке или их содержании
Определение пенициллина в молоке с помощью бумажных
дисков. Метод основан на. методе Галеслота и Хассинга. Бумажные диски
пропитывают молоком и помещают на поверхность питательной среды,
инокулироваиной В. searohermophilus var. calidolacis, который особенно
чувствителен ,к пенициллину. В присутствии в молоке веществ, которые
ингибируют рост микроорганизма, вокруг диска образуется четкая зона.
Стандартный раствор пенициллина 100 МЕ/мл готовят
растворением натриевой соли бензилпенициллина в стерильной дистиллированной
воде. Раствор используют в течение дня, хранят при 5°С.
Раствор пенициллииазы 1000 ед./мл готовят растворением
пенициллиназы в стерильной дистиллированной воде. Хранят в холо дильнике при
температуре 5°С в течение 2 недель.
10%-ный раствор молока, свободного от ингибирующих
веществ, готовят при растворении сухого обезжиренного молока, которое
предварительно проверено на отсутствие ингибирующих ве£цёств.
Для анализа можно использовать свежее молоко. Его
разливают в бутылки, нагревают в течение 1 ч при 100иС и хранят в
холодильнике при 5°С не более 1 недели.
Тест-культуру В. searohermophilus var. calidolacis
поддерживают на косом агаре. Перевивку культуры выполняют петлей, посевы
выдерживают в термостате при 55± ГС 48 ч. После термостатирования резиновую
пробку заливают и плотно закрывают. В таком виде культуру сохраняют в течение
нескольких месяцев в холодильнике при температуре 5°С.
10 мл культуралыюй среды асептически переносят в
стерильную колбу Эрленмейера вместимостью 150 мл. Инокуляцию культуральной
среды производят петлей культуры, взятой с косого агара, или используют
жидкую 36-часовую культуру. Тсрмостатирование проводят при 55°С в течение
16—18 ч.
Одну часть свежеприготовленной жидкой культуры смешивают с
пятью частями расплавленной агаровой среды при 55±1°С в пробирке или бутылке.
Полученную смесь заливают в стерильную чашку Петри,
предварительно подогретую до 55°С, таким образом, чтобы слой агара в чашке
был толщиной не более 0,8—1,0 мм. Переносят чашки Петри | ка холодную горизонтальную
поверхность для застывания агара. Чашки используются в тот же самый день,
допускается хранение в холодильнике в полиэтиленовом пенале 5—7 дней при
температуре 5°С.
Рабочий раствор пенициллина готовят, добавляя 1,25 мл
стандартного раствора пенициллина к 1000 мл стерильной дистиллированной воды.
Этот раствор содержит 0,125 ИЕ/мл. Готовят 50 мл раствора, содержащего 0,0025
ИЕ/мл пенициллина, добавляя к молоку, не содержащему ингибирующих веществ, 1
мл рабочего раствора, и перемешивают. Готовят 50 мл раствора, содержащего
0,005 ИЕ/мл пенициллина, добавляя к молоку, свободному от ингибирующих
веществ, 2 мл рабочего раствора, и перемешивают. Растворы готовят в день
проведения анализа.
|