|
В настоящее время для практических
целей наибольший интерес представляет ферментативный сиптез аптибиотиков
микроорганизмами. Получение антибиотиков из макроорганизмов пока является
предметом научных исследований. Химический синтез аптибиотиков в
производственных масштабах осуществляется довольно редко (см. 4.1.6.3).
4.1.6.1. Биологический синтез
Па заре развития антибиотической промышленности основным
способом выращивания микроорганизмов были поверхпостные культуры. Питательный
раствор, содержавший необходимое количество углерода, азота и минеральных
веществ, наливали в стерильные плоские сосуды и закрывали ватными пробками.
Поверхность питательного раствора была сравнительно невелика. Микроорганизмы,
вырабатывавшие антибиотики, находились на поверхности раствора, где больше
всего было кислорода, выделяя продукты обмена веществ в питательный раствор.
В связи с малыми выходами аптибиотиков, большими затратами
труда и большой потребностью в площадях вскоре перешли к ныне общепринятым
глубинным культурам. Ферментативные процессы происходят в танках, или
ферментерах. Благодаря продуванию стерильного воздуха и перемешиванию
питательная среда непрерывно хорошо аэрируется, так что продуценты
развиваются во всей толще питательной среды. Резервуары для промышленного
производства антибиотиков изготовляют из нержавеющей стали полезпой емкостью
до 300 м3.
Ферментеры стерилизуют перегретым водяпым паром или
газообразным формалином. Питательные среды при подаче в ферментер стерилизуют
и доводят до нужной температуры. Питательные среды можно стерилизовать
непосредственно в малых ферментерах путем нагревания водяпым паром под давлепием.
Выращивание посевного (прививочного) материала начинают с
посева спор агаровой культуры штамма-продуцента па предварительную среду;
выращивание ведут па качалках. Полученный материал используют для засева в
предварительную среду, находящуюся в более крупных сосудах на качалках или в
малых ферментерах.
среды. Среды для получения посевного материала и
ферментации антибиотиков различаются как в качественном, так и в
количественном отношениях. Питательную предварительную среду готовят с
расчетом обеспечения хорошего роста мицелия и индукции ферментных систем,
необходимых для последующего синтеза антибиотиков. Основная питательная среда
должна обеспечивать прежде всего максимальный выход продукта. После засева
основной среды происходит быстрое размножение микроорганизмов продуцента без
сопутствующего образования существенного количества аптибиотика (тро-
фофаза). Затем размножение и рост клеток приостанавливаются, а в процессе
обмена веществ образуются вторичные метаболиты (идиофаза). Па этой стадии
концентрация антибиотика в культуральной жидкости увеличивается, причем
скорость этого процесса зависит от природы антибиотика. При несвоевременной
остановке ферментации концентрация антибиотика
в культуральной среде может снизиться вследствие
гидролитических процессов ( 4.4).
Б ферментерах периодически проверяют концентрацию
антибиотиков (см. 4.1.7), стерильность и другие физиологические параметры.
После достижения требуемой биологической активности ферментацию прекращают, а
культуральную жидкость направляют на химическую обработку для получения
активного продукта (см. 4.1.8.2).
Микроорганизмы, выделенные из природных субстратов, как
правило, характеризуются слабой способностью синтезировать антибиотики.
Увеличение выхода активного продукта в производственных условиях достигается
селекцией продуктивных штаммов микроорганизмов-продуцентов, а также
оптимизацией условий ферментации.
Важнейший фактор оптимизации условий ферментации — это
подбор подходящих питательпых сред для наращивания продуктивного штамма и для
самой ферментации. Требования различных продуцентов антибиотиков к
количественному и качественному составу питательных сред неодинаковы. По в
принципе любая питательная среда должна содержать хотя бы одип источник
углерода, один источпик азота, а также неорганические соли и вещества с
буферными свойствами.
В исследовательских работах по фермептациям часто
применяют синтетические питательные среды известного состава. В
микробиологической же промышленности по экономическим соображениям
применяются также сложные питательные среды. Так, в питательные среды
включают такие природные вещества, как растительные полисахариды, жиры и
масла, сухие дрожжи и даже отходы различных производств (меласса, соевый
шрот, вода, в которой замачивалась кукуруза). Для того чтобы не было перебоев
в работе, состав добавок должен быть однородным, они не должны содержать
вредных примесей — тяжелых металлов, сульфитов и т. п.
Наиболее благоприятный состав питательной среды обычно
устанавливают эмпирически, путем качественного и количественного изменения
состава компонентов, применяя при этом соответствующие способы оптимизации
процесса. Исследования проводятся сначала в лабораторном масштабе. Испытуемые
питательные среды находятся в колбах. После стерилизации и засева проводят
инкубацию на качалках (для лучшей аэрации). Оптимальные питательные среды
затем проверяют па полупроиз- водствеиных установках (от 10 до 4000 л). При благоприятных результатах средьт используют в промышленной ферментации.
Выход антибиотиков при ферментации можно значительно
увеличить впесением в питательную среду предшественников, т. е. веществ,
химическое строение которых идентично какой-либо части молекулы
соответствующего аптибиотика. Предшественники могут быть использованы и в
качестве промежуточных соедипений при синтезе антибиотика. Важными
предшественниками для биосинтеза пенициллина G (бепзилненициллин) являются
фепилуксуспая кислота и ее производные, а для синтеза эритромицина,
гризеофульвипа п других антибиотиков — н-пропанол и про- лионовая кислота.
Ход ферментации зависит от температуры. Для ферментации со
стрептомицетами благоприятная температура находится в пределах 28—30°С, для
грибов — около 24°С, для бактерий - 35—37°С,
Регулирующее действие на биосинтез антибиотиков оказывает
рП средьт. В начале фермептации вследствие расщеилепия углеводов до
углекислоты и органических кислот цикла Кребса происходит значительное
подкислепие средьт, компенсируемое добавкой порций карбоната кальция в
питательную среду. Азотистые компоненты питательной среды расщепляются медленнее;
выделяющиеся аммиак и другие соединения азота имеют щелочную реакцию, что
приводит к сдвигу рН среды в щелочную область ( 4.4). Добавлением
разбавленпых растворов минеральных кислот или физиологически кислых солеи
необходимо поддерживать рИ на уровпе, оптимальном для образования антибиотика
(чаще всего это РН7).
Рост аэробных продуцентов антибиотиков и их синтезирующая
способность зависят от аэрации культуральпой жидкости. В качал очных
культурах наружный воздух диффундирует в культуральпую жидкость, поверхпость
которой значительно увеличивается благодаря вращательпо- му или
возвратно-поступательному движению.
В ферментеры подают стерильный воздух. Для лучшего
распределения воздуха, поступающего в культуральпую жидкость через узкие,,
расположенные кольцами отверстия, в ферментере предусматривают сильную
мешалку.
Важную роль играет селекция высокопродуктивных штаммов
соответствующего продуцента аптибиотика. Предпосылка успеха такого рода работ
заключается в скачкообразных гепетических изменениях у отдельных особей
популяции. Такие изменения называют мутациями, а организмы с измененной
генетической информацией — мутантами.
Увеличение антибиотической активпости селектируемого
мутантного штамма может обусловливаться непосредственным измепепием
информации полигеппо контролируемого образования антибиотиков. Устойчивое
усиление синтеза возможно также в результате мутации тех генов, которые
определяют проницаемость клеточной оболочки, использование питательных
веществ клетками продуцента и т. д.
Спонтанные мутации происходят очепь редко, и частота их у
разных организмов по различпым признакам неодинакова. Естественно,
перспективы отбора спонтанных мутаптов с высокой биосиптетической
продуктивностью ограпичены. На отборе мутантов основана так называемая
поддерживающая селекция, В технической микробиологии опа применяется для
сохранепия основных качественных и количественных характеристик продуктивного
штамма.
Для получения продуктивных штаммов продуцентов
антибиотиков воздействуют на микроорганизмы или суспензии спор мутагенами —
агентами, вызывающими мутации. В результате такой обработки резко
увеличиваются частота мутаций, широта изменчивости популяции, создаются
условия для отбора. Механизм действия мутагенов осповап на прямых или
косвенных изменениях генетической информации, т. е. на химических
модификациях ДНК, касающихся последовательности оснований. Большей частью
мутагены оказывают вредное воздействие па микроорганизмы, могут привести к их
гибели.
Существуют физические мутагены (ультрафиолетовые и
ионизирующие излучения, ультразвук, перегрев) и химические мутагены (алки-
лирующие агенты, антиметаболиты, перекиспые соедипения, осповные красители и
др.). Несмотря па разнообразие мутагенов, певозможпо обеспечить направленные
мутации, которые существенно облегчили бы селекцию.
У парасексуальпых организмов, например у бактерий и
стрептомице- тов, гепетический материал можно перепосить путем трансформации,
трансдукции и рекомбинации [108]. Такие воздействия играют все большую роль в
технической микробиологии.
Основная трудность селекциоппой работы заключается в
обнаружении мутантов с требуемыми свойствами. К сожалепию, очень редко
существует корреляция между целью селекции и легко заметными внешними
признаками организма, например формой роста, видом колоний, образованием
пигмента и др.
Результаты селекции микроорганизмов, образующих
антибиотики, в большинстве случаев оцениваются только по антибиотической
активности в глубинных культурах, для определения которой требуется много
труда и времени.
Химическое выделение
Успех химического выделепия аптибиотика из культураль- пой
жидкости всецело определяется его физико-химическими свойствами. В связи с
разнообразием химического строения, неодинаковой растворимостью и разной
стабильностью природных антибиотических веществ разработаны различные способы
их выделения и очистки. Подробно эти способы описаны в специальных
руководствах [14, 15, 48, 70, 71, 97, 109].
Чаще всего для выделения антибиотиков применяют экстракцию
органическими растворителями, которые по смешиваются или плохо смешиваются с
водой. В крупном производстве сейчас в основном применяют многоэтапное
нротивоточпое распределение.
В зависимости от распределения антибиотического вещества —
равномерно между компонентами культурального материала или преимущественно в
мицелии пли водной среде (фильтрат культуральпой жидкости) — обрабатывают
культуральпую жидкость различно. Например, для получения гризеофульвина,
актипомицинов ее обрабатывают целиком, а для получения нистатина отделяют
мицелий, для нолучепи пенициллина — только свободный от мицелия фильтрат.
Чтобы получить антибиотики из растительных или животных
ткапей, последние топко измельчают. Экстрагирование проводят из свежего или
высушенного материала преимущественно смешивающимися с водой органическими
растворителями (низшие спирты, кетопы).
Антибиотики с ионными свойствами, например основные
стрептомицин и наромомицин, можпо выделять из фильтратов культуральпой
жидкости путем адсорбции па ионообменнжках. После элюции активного вещества с
адсорбента получают пеочищеппый концептрат.
Антибиотики из культурального фильтрата можно выделять
осаждением веществами, образующими нерастворимые соединения. Так, нри
производственном получении окситетрациклипа антибиотики осаждают
четвертичными азотистыми основаниями с длинной цепыо, а также ионами кальция
или магния. Осадок собирают, нромывают, а затем разлагают соляной кислотой,
причем образуется кристаллизуемый гидрохлорид ок- сит етр ацик л ин а.
Сырые копцептраты или вещества для получения чистых
препаратов должны быть освобождены от примесей. Этого обычно достигают
различными методами хроматографии, повторным осаждением, высаливапием и
перекристаллизацией. Термоустойчивые аптибиотики очищают также пе- регопкой
(например, элайомицин) или возгонкой (например, стрептоцин). Степень чистоты
препарата аптибиотика характеризуется обычно биологической активностью па
единицу массы, т. е. числом единиц активпости на миллиграмм препарата.
4.1.6.3. Химический синтез
В результате интенсивных поисков путей химического
производства антибиотиков удалось синтезировать лишь хлорамфеникол; в
настоящее время в продажу поступает преимущественно синтетический препарат.
Различные способы химического синтеза описали Маргрейтер и Гапп [79].
Химический способ получепия других антибиотиков имеет лишь научный иптерес,
потому что по экономичности оп значительно уступает методам биологического
синтеза. В последнее время пачали синтезировать пенициллин.
4.1.6.2.
Все большее значение приобретают так называемые
полусиптетиче- ские антибиотики, обладающие, как правило, очень хорошими
терапевтическими свойствами. Их получают путем вторичных химических
превращений аптибиотиков, выделенных методом ферментации. Примером ме- жет
служить группа пенициллинов.
В оспове строения пенициллинов лежит 6-аминоненициллановая
кислота, которую получают в результате ферментативного расщеплепия био-
сиптетических пенициллинов (например, бепзилпенициллина, фенокси-
метилненицшглина) или непосредственно при фермептации без предптест-
вепников. Химическим алкилированием 6-аминопешщиллаповой кислоты хлоридом
кислоты с боковой цепыо желаемой длины получены так называемые
нолусиптетпческие пенициллины, в том числе и такие, которые до сих пор не
были получены при ферментациях. Некоторые представители этой большой и
разнообразной группы аптибиотиков имеют большое терапевтическое значение.
Боковая цепь а-фепоксипенициллина является производной
а-окси- нропионовой кислоты. Благодаря стойкости к кислотам и хорошему
всасыванию в желудке и кишечнике этот антибиотик вполне пригоден для
перорального введения. Полусиптетический 2,6-диметоксифепилпепицил- лип менее
активеп по отношению к стафилококкам, чем бензилнепицил- лин, по значительно
более устойчив к пенициллипазе. Путем введения а- а м ино ф е пи л у к су сп
ой кислоты получают а-аминофенилпепициллин, который обладает высокой
активностью также по отпошению к грам-отри- цательным бактериям (широкий
спектр действия).
|