Ученые обычно стараются свести рассматриваемые проблемы к возможно более простым вещам. Еще в прошлом веке биологам стало ясно, что структурной и функциональной единицей всякого организма является клетка. Конечно, у одноклеточных клетка —это и есть организм, но многоклеточное состояние означает появление новых проблем, таких, как организация и дифференциация, взаимодействие и конкуренция клеток. И хотя ни один серьезный биолог не станет утверждать, что понимание событий на клеточном уровне способно дать нам полное представление об организме в целом, почти все исследователи согласны в том, что именно клетка есть тот логический исходный пункт, с которого следует начинать всестороннее изучение организма.

ПОДХОДЫ К ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТКИ

Биологи изучают клетки различными методами. На первом месте среди них естественно назвать прямое визуальное наблюдение, однако такому наблюдению поддаются лишь самые крупные клетки. Для более мелких требуется увеличение, которого можно достичь при помощи простой лупы (приблизительно 10Х) или обычного микроскопа, имеющего систему линз (до ЮООХ). В световом микроскопе живая трехмерная клетка представляется иногда очень сложным, изменчивым и неупорядоченным образованием. Стремясь к получению более простой и стабильной картины, биологи научились убивать клетки и сохранять их путем погружения в какой-нибудь фиксатор, например в формальдегид. Убитые и фиксированные клетки отмывают, обезвоживают проведением через спирт, заливают в какую-нибудь плотную среду, например в парафин или пластмассу, а затем приготовляют из них тонкие срезы с помощью бритвы или микротома. При благоприятных условиях микротом дает возможность получать срезы толщиной от 1 до 10 мкм. Для того чтобы выявить отдельные клеточные структуры, эти тонкие срезы помещают последовательно в различные красители, отличающиеся друг от друга растворимостью и молекулярным зарядом и вследствие этого адсорбируемые разными клеточными структурами. При достаточно тщательной работе и соответствующем навыке можно таким путем получить картину, в которой отдельные клеточные структуры будут окрашены по-разному, скажем ядерный материал — в розовый цвет, цитоплазматичес- кие структуры — в зеленый или фиолетовый с разными оттенками, а клеточные стенки не окрашены вообще или окрашены еще в какой-нибудь цвет. Почти все из того, что мы теперь знаем о клетке, ученые выяснили именно таким способом, используя различные методы фиксации материала, заливки его в среду, приготовления срезов и окрашивания.

Еще большее увеличение (до 1 ООО ООО X) обеспечивает электронный микроскоп. В нем вместо светового пучка используется пучок электронов, что дает возможность получить большее разрешение, поскольку разрешающая способность обратно пропорциональна длине волны используемого излучения, а длины волн де Бройля электронов очень малы по сравнению с длинами волн видимого диапазона спектра. Теоретический предел разрешения в электронном микроскопе пока не достигнут. Объясняется это тем, что электрический «шум» в магнитных линзах, фокусирующих пучок электронов, делает изображение нестабильным. Однако недавние усовершенствования, рассчитанные на то, чтобы снизить этот «шум» (например, сильное охлаждение линз), позволяют надеяться, что в конце концов в> электронном микроскопе удастся достичь еще большего разрешения.

Для электронной микроскопии из залитых в пластмассу клеток приготовляют тонкие срезы при помощи алмазных или стеклянных ножей. Затем срезы обрабатывают такими реагентами, как четырехокись осмия; эти реагенты избирательно присоединяются к различным клеточным структурам и делают их в разной мере непрозрачными для электронов. После этого на фотографической пластинке или на флуоресцентном экране изучают детали полученной картины. Структуры на электронных микрофотографиях не окрашены — они черные, белые или серые; получать цветные изображения мы пока еще не научились.

Еще один способ получения информации о клетках связан с химическим исследованием выделенных клеточных органелл. Если осторожно растереть клеточную массу в соответствующей среде, то по крайней мере часть клеточных органелл можно выделить в интактном виде. Органеллы, имеющие различную плотность, разделяют центрифугированием при постоянно возрастающем числе оборотов ( 2.1). Например, такие тяжелые частицы, как ядра и хлоропласта, осаждаются при сравнительно небольших скоростях, соответствующих центробежным силам, в 1000—3000 раз превышающим силу земного притяжения (1000—3000 g); митохондрии переходят в осадок примерно при 10 000 g, рибосомы — приблизительно при 30 000 g, а для более мелких частиц и для крупных молекул может потребоваться и еще в 100 раз большая скорость центрифугирования. Дифференциальное центрифугирование наряду с другими методами (ступенчатым фильтрованием, физической абсорбцией и элюцией или разделением по величине электрического заряда) позволяет получать в достаточных количествах отдельные виды клеточных органелл или их фрагментов. Полученные хлоропласта, митохондрии, рибосомы, мембраны и прочие фрагменты используются затем для экспериментов, цель которых состоит в том, чтобы определить химическую природу и биохимическую активность каждой из этих выделенных фракций.

РАЗМЕРЫ И ФОРМА КЛЕТОК

Размеры различных клеток варьируют чрезвычайно сильно— диаметр ряда бактерий не достигает и одного микрометра (мкм), длина же некоторых вытянутых клеток измеряется миллиметрами (мм). Даже в сравнительно небольшой бактериальной клетке содержится около 1012 молекул. Эта чудовищная сложность основной биологической единицы позволяет понять, почему биологические исследования и по методам, и по точности результатов столь существенно отличаются обычно от экспериментов физических и химических, где исследователи часто имеют дело с такими элементарными единицами, как отдельный протон или квант.

Если растительная клетка выращивается изолированно, то форма ее обычно приближается к сферической ( 2.2), но если она растет в окружении других клеток, то они сдавливают ее, и тогда она принимает форму многогранника. Клетка из зоны растяжения стебля или корня по форме напоминает коро- бочку длиной около 50 мкм, шириной 20 мкм и высотой 10 мкм. Объем ее равен приблизительно 10 000 мкм3. В одном кубическом сантиметре (1 см3) при плотной упаковке помещается до 100-106 таких клеток. Структура растительной клетки сложна и высокодифференцированна, но в первом приближении мы можем вычленить в ней три главные зоны: 1) клеточную стенку — сравнительно жесткое образование, по всей вероятности неживое, представляющее собой высокоструктурированную и в химическом отношении сложную смесь веществ, выделяемых протопластом; 2) протопласт — живую часть клетки, в которой заключены все клеточные органеллы, суспендированные здесь в сложном растворе, и 3) вакуоли — неживые образования, как бы мембранные мешки, служащие резервуарами или хранилищами клетки; они заполнены водным раствором поглощенных клеткой неорганических солей и органических веществ, представляющих собой продукты метаболической активности клетки. Клеточные стенки у растения играют роль скелета, т. е. обеспечивают должную жесткость и способствуют сохранению формы организма. Вакуоли также участвуют в выполнении этой функции — за счет давления, оказываемого их содержимым на цитоплазму и стенку клетки. Кроме того, вакуоли служат своеобразной секреторной системой, так как попадающий в них мате- териал тем самым эффективно выводится из сферы активных химических превращений, совершающихся в клетке. Остается, таким образом, протопласт, и именно в нем следует вам видеть арену той непрерывной активности, которая характеризует высокоорганизованное и динамическое состояние, именуемое жизнью.

МЕМБРАНЫ

Видны клеточная стенка, расположенное в центре ядро, окруженное крахмальными зернами, и тяжи цитоплазмы, пронизывающие крупную вакуоль.

Протопласт снаружи и изнутри ограничен мембранами — плазмалеммой и тонопластом; плазмалемма отделяет его от клеточной стенки, а тонопласт — от вакуоли. В электронном микроскопе (при увеличении в миллион раз и более) эти мембраны, соответствующим образом окрашенные, выглядят как две темные полосы, расположенные на расстоянии 6—10 нм друг от друга (  2.3). В протопласте имеются также различные тельца, так называемые органеллы. Среди них прежде всего бросаются в глаза одно крупное ядро и многочисленные более мелкие митохондрии и хлоропласты ( 2.3 и 2.4). У каждой из органелл есть свои функции. Эти функции осуществляются в уникальной внутренней среде, создаваемой избирательной проницаемостью и другими специфическими свойствами мембран, окружающих органеллу и отделяющих ее от всего остального протопласта. Избирательная проницаемость означает, что различные вещества проникают сквозь данную мембрану с разными скоростями, в основном по причине разной их растворимости в отдельных компонентах мембраны. Кроме того, в мембранах имеются также своеобразные «насосы», т. е. системы, активно перекачивающие через мембрану те или иные вещества с использованием для этой цели энергии. Результатом такой деятельности оказывается неравномерное распределение

некоторых веществ или элементов: калий, например, присутствует обычно в протопласте в значительно более высокой концентрации, нежели в наружной среде, тогда как родственный ему элемент натрий у большинства растений практически «выталкивается» из протопласта.

Методом дифференциального центрифугирования мембраны выделяют из клеток (при этом в осадке оказывается смесь различных мембран) и подвергают химическому анализу. В процессе выделения мембраны обычно рвутся, поскольку это структуры тонкие и хрупкие, с весьма большой площадью поверхности; однако затем концы их фрагментов часто сливаются, и тогда возникают сферические пузырьки. Анализ таких пузырьков, полученных из большого числа различных мембран, выявил в них присутствие двух главных компонентов: белка и фосфо- липида. Липиды из разных мембран в достаточной мере сходны, что же касается белков, то каждому типу мембран свойственсвой тип белка, соответствующий тем физиологическим функциям, которые данная мембрана выполняет в клетке. Известно*, например, что активные белки (ферменты), регулирующие транспорт минеральных веществ — поступление их в клетку и выход из клетки, — локализуются в плазмалемме и тонопласте; ферменты, участвующие в фотосинтезе, сосредоточены в мембранных системах зеленых хлоропластов; и наконец, ферменты, катализирующие окислительные реакции процесса дыхания, находятся в митохондриальных мембранах.

Если смешать соответствующие фосфолипиды и белки и нанести эту смесь на поверхность воды, то спонтанно образуются мембраноподобные структуры, сходные по толщине с биологическими мембранами. Исследование таких искусственных мембран, приготовленных из белков и липидов природных мембран, дает нам возможность лучше понять структуру и функцию биологических мембран. Искусственные мембраны обнаруживают разную проницаемость для разных ионов в зависимости от природы белков и липидов, входящих в их состав. Чрезвычайно интересные эффекты можно наблюдать при добавлении к искусственным мембранам некоторых антибиотиков. Валиномицин, например, благодаря своей структуре (т. е. определенным размерам и заряду молекулы) оказывается способным притягивать и удерживать ионы калия, но не притягивает ионов натрия ( 2.5). Если добавить валиномицин к искусственной мембране, отделяющей растворы с ионами К+ и Na+ от чистой воды,

то скорость перемещения ионов К+ через мембрану возрастет в несколько раз, тогда как скорость переноса ионов Na+ останется практически неизменной. Иначе действует грамицидин, молекула которого имеет иные размеры и другую структуру: при добавлении к мембране грамицидина увеличивается скорость переноса обоих ионов — не только К+, но и Na+. Искусственные мембраны используются также для изучения механизмов, при помощи которых свет и гормоны регулируют рост растений (об этом мы будем говорить в гл. 11).

Плазмалемма обращена одной своей стороной к клеточной стенке, а другой — к цитоплазме; обе эти оводненные структуры контактируют, как принято считать, с гидрофильными, заряженными участками мембран. Поскольку белки содержат больше заряженных групп, чем липиды, в первых моделях мембран предполагалось, что плазмалемма состоит из двух наружных белковых слоев (две темные линии на  2.3) и одного липид- ного слоя между ними. Такая модель мембранной структуры оставалась общепризнанной до начала 1970-х гг., когда были получены некоторые новые данные и стало ясно, что модель нуждается в пересмотре. Несовместимыми с этой моделью «сэндвича» оказались, например, данные электронной микроскопии, полученные методом замораживания — травления. Исследуемую ткань сначала замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают тупым микротомным ножом, так что скол проходит в плоскости, параллельной поверхности мембраны ( 2.6). После этого образец выдерживают под вакуумом для возгонки льда (сублимации). Эта процедура и называется травлением. Затем образец напыляют углем или металлом, чтобы выявить детали строения обнажившейся поверхности. Полученная таким образом реплика (копия) поверхности препарата и является объектом электронно-микроскопического исследования ( 2.7). На таких репликах видны вкрапленные в гладкую поверхность мембраны крупные частицы — глобулярные белки. Наличие особого «рисунка» поверхности мембраны удалось подтвердить и другим методом, а именно с помощью лек- тинов — особых белков (их выделяют из семян), которые прикрепляются к дискретным и специфическим белковым рецепторам на мембранной поверхности и позволяют выявить эти рецепторы.

Результаты, полученные этими и некоторыми другими методами, дали возможность предположить, что мембраны имеют мозаичное строение и состоят из липидного матрикса, в который в разных местах вкраплены белки ( 2.8). Такая модель учитывает, что не все участки белковой молекулы гидрофильны, а липиды не полностью гидрофобны. Согласно этой модели, заряженные (полярные) группы белковых и липидных молекул находятся на наружной поверхности мембраны, в контакте с клеточной водой, а незаряженные (неполярные) группы образуют внутреннюю гидрофобную часть мембраны. Предполагается также, что одни белки непрочно прикреплены к наружной поверхности мембраны, тогда как другие (так называемые интегральные белки) пронизывают вскктолщу мембраны. К такому заключению приводят биохимические эксперименты: они показывают, что часть белков легко отделяется от мембран, а отделение других оказывается возможным лишь после полного распада мембранной структуры.

На основании первых исследований структура мембран представлялась нам стабильной и жесткой, однако в последнее время быстро накапливаются данные, свидетельствующие о том,, что по крайней мере липидный компонент мембран имеет жидкостную природу и, следовательно, мобилен. Кроме того, опыты с радиоактивно меченными предшественниками отдельных мембранных компонентов показали, что скорость метаболического обновления некоторых участков мембраны очень высока, т. е. что эти участки непрерывно разрушаются и ресинтезиру- ются. Вводя меченые предшественники в зрелую ткань, мы можем наблюдать, как они включаются в мембраны, остаются в них на протяжении нескольких часов, а затем исчезают из мембран и обнаруживаются в каких-нибудь других частях клетки.