|
Для выделения белков биологический
материал измельчают до разрушения клеточных стенок, получая гомогенат.
Для этой цели применяют следующие способы: растирают ткани с твердым
материалом — абразивом (кварцевый песок) в ступке; используют специальные
вальцовые или шаровые мельницы, вращающиеся с большой скоростью острые ножи;
продавливают в замороженном состоянии через фильеры специального пресса; применяют
ультразвуковые дезинтеграторы и др. При разрушении биологических тканей и
выделении белков всегда необходимо иметь в виду их большую неустойчивость,
лабильность, склонность к утрате нативных свойств — денатурации. Затем пробу
обезжиривают и приступают к извлечению белков. Наиболее часто белки извлекают
водой или солевыми растворами. Для извлечения белков используют также
спирто-водные смеси.
В состав биологических тканей входит множество белков.
Большие трудности составляет разделение суммарной белковой смеси на
индивидуальные белки — их фракционирование. Известно много методов
фракционирования белков: органическими растворителями, электрофоретические,
хроматографические, молекулярными ситами (сефадексами) и др.
Фракционирование растворителями. Для этого применяют
этанол, ацетон, дибксан и другие в строгих условиях рН и температуры.
Электрофоретические методы. Основаны на движении
заряженных молекул белков в электрическом поле. Скорость перемещения молекул
белка зависит от величины их зарядов при определенном рН и ионной силе
раствора. Некоторое влияние оказывают форма и масса белковых молекул.
Электрофорез проводят в растворе или на твердых влажных средах — в геле из
крахмала, производных целлюлозы, полиакриламида (ПААГ), силикагеля, на хроматографической
бумаге. Большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до
выделения индивидуальных белков достигается при разновидности электрофореза,
называемого изоэлектрическим фокусированием. Здесь разделение белков
происходит в поддерживающих средах с определенным градиентом рН, что
обеспечивает положение белка на определенном уровне в колонке. Градиент рН
создают с помощью полиаминополикарбоновых кислот — ам- фолинов, дающих
диапазон рН от 3 до 10.
Хроматографические методы. Основаны на разделении смеси
веществ на основе их физико-химических различий между двумя фазами, одна из
которых неподвижная, а другая — поток, фильтрующийся через неподвижную фазу.
При жидкостной хроматографии подвижной фазой бывает жидкость, при газовой —
газ. Существует несколько видов хроматографии. При адсорбционной
хроматографии разделение смеси веществ происходит в результате различия их
физической сорбции. При помощи распределительной хроматографии вещества из
смеси распределяются между двумя разными не -смешивающимися жидкостями.
Принцип ионно-обменной хроматографии — ионные
взаимодействия между растворенными веществами и носителем. В химии белков
наиболее часто применяют ионно-обменную, моле- кулярно-ситовую
(гель-проникающую) и аффинную хроматографию. При ионно-обменной хроматографии
белки взаимодействуют с противоположно заряженными частицами ионно-обменных
смол (ионитами) —твердых нерастворимых веществ, заполняющих колонку, и
вследствие этого разделяются. Ионнообменник имеет иониты, содержащие активные
группы основного характера и подвижные анионы (аниониты), и иониты, в состав
которых входят активные кислотные группы и способные к обмену подвижные
катионы (катиониты)..
Гель-проникающую хроматографию (гель-фильтрацию) называют
еще молекулярным ситом. С помощью этого метода белки разделяют по размерам их
молекул.
При аффинной хроматографии (хроматографии сродства)
специально подобранные твердые носители избирательно связывают строго
определенные белки. Аффинная хроматография позволяет очень точно
фракционировать белки.
Выделение молекулярными ситами. Для этого берут сефа- деке
— специальный пористый материал, получаемый обработкой эпихлоргидрином
полисахарида декстрана.
В колонку, содержащую сефадекс ( И), частицы которого
окружены водной оболочкой и уравновешены .буферным» раствором, вносят раствор
смеси двух веществ разной молекулярной массы — белок и, например, соль. При
фильтровании через гель сефадекса низкомолекулярное вещество (соль) медленно
диффундирует через поры набухших в воде частиц: сефадекса. Более
высокомолекулярное вещество (белок) быстрее просачивается между частицами
сефадекса и получается в: свободном от низко молекулярных примесей виде. При
последующем промывании колонки тем же буферным раствором? 'медленно
диффундирующее низкомолекулярное вещество (соль) удаляется. Таким образом
регенерируют колонку. Выделенные белки часто содержат различные примеси. Для
их, удаления применяют очистку белков с помощью диализа, электродиализа,
ультрафильтрации.
Очистку диализом проводят следующим образом/ Диализа-
дионный мешочек из полупроницаемого материала (целлофана* и др.), в который
помещают исследуемое вещество, погружают на несколько суток в сосуд с
проточной водой. Низкомолеку-
лярные соединения и ионы отмываются, а крупные молекулы
белка остаются в мешочке.
Наиболее быстрого и полного удаления ионов добиваются при
помощи электродиализа ( 12, б). Кроме полупроницаемых мембран, ставят
электроды, на них подают напряжение. В результате ионы переходят в омывающую
Мембрану воду и удаляются из аппарата. Для очистки белков методом
ультрафильтрации используют полупроницаемые мембраны высокой прочности с
калиброванными порами, через которые белковый раствор продавливают сжатым
газом или центробежной силой.. При насыщении белкового раствора солью белки
можно получить в кристаллическом виде. Ранее упоминавшаяся гель-фильтрация с
сефадексом также дает хорошие результаты при очистке белков от
низкомолекулярных примесей.
Каждый индивидуальный белок состоит из одного вида
молекул, имеет определенную молекулярную массу, состав в строение. Это
диктует необходимость оценки гомогенности, т. е. однородности выделенных и
очищенных белков. Для этого применяют большое число методов, общим признаком
которых является выявление физико-химических особенностей, характерных только
для гомогенного белка, ©чень важным способом определения однородности белков
является их исследование в= ультрацентрифуге. Принцип работы ультрацентрифуги
заключается в том, что раствор, содержащий белковые молекулы.
С помощью ультрацентрифуги можно разделить белки,
различающиеся по молекулярной массе. Аналитическая ультрацентрифуга снабжена
оптическим устройством, регистрирующим результаты анализа в виде кривой при
прохождении света через специальные ячейки, содержащие раствор исследуемого
белка. Однородный по молекулярной массе белок при испытании в ультрацентрифуге
на кривой дает один симметричный пик. Если на диаграмме получается два пика
или один несимметричный, то это значит, что белковый препарат представляет
собой смесь по меньшей мере двух белков. Для определения однородности белков
широко используют также разные виды хроматографии, в том числе и ранее
рассмотренныеГДля определения однородности белка необходимо применять разные
методы.
|